Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

המחבר מבקש להודות לשאונה ריד, ד. סקוט סמואלס ופטריק סקור על הדיון המועיל שלהם ולווריון (פאם) צ'ונוואראוונג על עזרתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעים ביו-רפואיים ומענקי מחקר מהפקולטה לכריסטיאן ה. אגרס מבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת קוויניפיאק.

כל הניסויים המשתמשים בדנ"א רקומביננטי ובאורגניזמים BSL-2 נבדקו ואושרו על ידי הוועדה הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת קוויניפיאק.
1. הכנת תרבות B. burgdorferi לייצור φBB-1
<ol><li>הכינו את סרום הארנב הרגיל (BSK) של ברבור-סטונר-קלי בתוספת של 6.6% סרום ארנבת רגיל (BSK) המומת <sup class="xref...

השימוש בהתמרה יכול לייצג שיטה אחת להתגבר לפחות על חלק מהמחסומים הביולוגיים והטכניים הקשורים לאלקטרו-טרנספורמציה של B. burgdorferi 1,4,13,37. במערכות רבות, בקטריופאג' יכול להעביר דנ"א מארח (שאינו נבוא) בין תאי חיידקים על ידי ה...

פיתוח כלים למניפולציה גנטית של החיידק הספירוכטלי Borrelia burgdorferi הוסיף ערך לאין שיעור להבנת טבעה של מחלת ליים 1,2,3,4. ל-B. burgdorferi יש גנום מורכב במיוחד המורכב מכרומוזום ליניארי קטן ופלסמידים ליניאריים ומעגליים 5,6. אובדן פלסמיד ספונטני, סידור מחדש תוך-גני (תנועה של גנים מפלסמיד אחד למשנהו בתוך אותו אורגניזם) והעברת גנים אופקית (HGT, תנועת הדנ"א בין שני אורגניזמים) הולידו כמות מסחררת של הטרוגניות גנטית בקרב B. burgdorferi (לדוגמה, ראו Schutzer et al.7). הגנוטיפים המתקבלים (או "זנים") הם כולם בני אותו המין, אך יש הבדלים גנטיים המשפיעים על יכולתם להעביר ולהדביק פונדקאים שונים שליונקים 8,9,10,11. בדו"ח זה, המונח "זן" ישמש להתייחסות ל- B. burgdorferi בעל רקע גנטי טבעי מסוים; המונח "שיבוט" ישמש להתייחסות לזן שעבר הנדסה גנטית למטרה מסוימת או כתוצאה ממניפולציה ניסיונית.
ארגז הכלים המולקולרי הזמין לשימוש ב- B. burgdorferi כולל סמנים הניתנים לבחירה, כתבי גנים, וקטורים של מעבורת, מוטגנזה טרנספוזונית, מקדמים אינדוקטיביים וסמנים הניתנים לבחירה נגדית (לסקירה, ראו Drektrah ו- Samuels12). השימוש היעיל במתודולוגיות אלה מחייב החדרה מלאכותית של דנ"א הטרולוגי (זר) לתוך זן עניין של B. burgdorferi. ב- B. burgdorferi, הכנסת דנ"א הטרולוגי מושגת כמעט אך ורק באמצעות אלקטרופורציה, שיטה המשתמשת בפולס של חשמל כדי להפוך קרום חיידקי לחדיר באופן זמני לפיסות דנ"א קטנות שהוכנסו למדיה1. רוב התאים (הנאמדים ב-≥99.5%) נהרגים על ידי הדופק, אך לתאים הנותרים יש תדירות גבוהה של שמירה על הדנ"א ההטרולוגי13. למרות שנחשב לאחת השיטות היעילות ביותר להחדרת דנ"א לחיידקים, תדירות האלקטרופורציה לתוך B. burgdorferi נמוכה מאוד (החל מטרנספורמציה אחת ב-5 × 104 עד 5 × 106 תאים)13. נראה כי המחסומים להשגת תדרים גבוהים יותר של טרנספורמציה הם טכניים וביולוגיים כאחד. מחסומים טכניים לאלקטרופורציה מוצלחת של B. burgdorferi כוללים הן את כמות הדנ"א (>10 מיקרוגרם) הדרושה והן את הדרישה של הספירוכטים להיות בדיוק בשלב הגדילה הנכון (אמצע יומן, בין 2 × 10 7 תאים·mL−1 ו-7× 107 תאים·mL−1) בעת הכנת תאים אלקטרו-מוכשרים12,13. עם זאת, מחסומים טכניים אלה עשויים להיות קלים יותר להתגבר מאשר על המחסומים הביולוגיים.
חוקרי מחלת ליים מכירים בכך שניתן לחלק את שיבוטי B. burgdorferi לשתי קטגוריות רחבות ביחס ליכולתם להיות מניפולציה גנטית13,14. מבודדים בעלי מעבר גבוה ומותאמים למעבדה משתנים לעתים קרובות בקלות, אך בדרך כלל איבדו את הפלסמידים החיוניים להדבקה, מתנהגים בצורה סוטה מבחינה פיזיולוגית, ואינם מסוגלים להדביק פונדקאי יונק או להתמיד בתוך וקטור קרציות12,13. בעוד ששיבוטים אלה היו שימושיים לניתוח הביולוגיה המולקולרית של הספירוצ'ט בתוך המעבדה, הם בעלי ערך מועט לחקר הספירוצ'ט בהקשר הביולוגי של המחזור האנזוטי. מבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך, לעומת זאת, מתנהגים באופן פיזיולוגי המשקף מצב זיהומי ויכולים להשלים את מחזור ההדבקה אך בדרך כלל הם סרבנים להכנסת דנ"א הטרולוגי ולכן קשה לתמרן אותם למחקר12,13. הקושי בהתמרת מבודדים בעלי מעבר נמוך קשור לפחות לשני גורמים שונים: (1) מבודדים בעלי מעבר נמוך לעיתים קרובות מתגבשים זה לזה בחוזקה, במיוחד בתנאי הצפיפות הגבוהה הנדרשים לאלקטרופורציה, ובכך חוסמים תאים רבים מיישום מלא של המטען החשמלי או מגישה לדנ"א במדיה13,15; ו-(ii) B. burgdorferi מקודד לפחות שתי מערכות שונות לשינוי הגבלה (R-M) המועברות על ידי פלסמידים, שעלולות ללכת לאיבוד במבודדים בעלי מעבר גבוה14,16. מערכות R-M התפתחו כדי לאפשר לחיידקים לזהות ולחסל דנ"אזר 17. ואכן, מספר מחקרים ב- B. burgdorferi הראו כי יעילות הטרנספורמציה עולה כאשר מקור הדנ"א הוא B. burgdorferi ולא Escherichia coli13,16. למרבה הצער, רכישת הריכוז הגבוה הנדרש של דנ"א לאלקטרופורציה מ- B. burgdorferi היא אפשרות יקרה וגוזלת זמן. חשש פוטנציאלי נוסף בעת אלקטרופולציה ובחירה במבודדים בעלי מעבר נמוך הוא שנראה שהתהליך מעדיף טרנספורמטורים שאיבדו את הפלסמיד הקריטי הקשור לווירולנציה, lp2514,18,19; לפיכך, עצם הפעולה של מניפולציה גנטית של מבודדי B. burgdorferi במעבר נמוך באמצעות אלקטרופורציה עשויה לבחור עבור שיבוטים שאינם מתאימים לניתוח רלוונטי ביולוגית בתוך המחזור האנזואטי20. בהתחשב בבעיות אלה, מערכת שבה דנ"א הטרולוגי יכול לעבור אלקטרופורמציה לשיבוטים של B. burgdorferi בעלי מעבר גבוה ולאחר מכן להעביר אותם למבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך בשיטה שאינה אלקטרופורציה יכולה להיות תוספת מבורכת לאוסף ההולך וגדל של כלים מולקולריים הזמינים לשימוש בספירוכטה של מחלת ליים.
בנוסף לטרנספורמציה (קליטת דנ"א עירום), ישנם שני מנגנונים נוספים שבאמצעותם חיידקים תופסים באופן קבוע דנ"א הטרולוגי: הצמדה, שהיא חילופי דנ"א בין חיידקים במגע פיזי ישיר זה עם זה, והתמרת, שהיא חילופי דנ"א בתיווך בקטריופאג'21. ואכן, היכולת של בקטריופאג' לתווך HGT שימשה ככלי ניסיוני לניתוח התהליכים המולקולריים בתוך מספר מערכות חיידקים22,23,24. B. burgdorferi אינו כשיר באופן טבעי לקליטת דנ"א עירום, ויש מעט ראיות לכך ש- B. burgdorferi מקודד את המנגנון הדרוש לקידום הצמדה מוצלחת. דוחות קודמים תיארו, עם זאת, זיהוי ואפיון ראשוני של φBB-1, בקטריופאג' ממוזג של B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 חבילות משפחה של פלסמידים של 30 קילובייט שנמצאו בתוך B. burgdorferi25; בני משפחה זו נקראו CP32S. בהתאם לתפקידו של φBB-1 בהשתתפות ב-HGT בקרב זני B. burgdorferi, סטיבנסון ואחרים דיווחו על cp32 זהה שנמצא בשני זנים עם cp32s שונים זה מזה, מה שמרמז על שיתוף לאחרונה של cp32 זה בין שני זנים אלה, ככל הנראה באמצעות התמרה29. יש גם עדויות לרקומבינציה משמעותית באמצעות HGT בקרב cp32s בגנום יציב יחסית 30,31,32,33. לבסוף, היכולת של φBB-1 לתמר גם cp32s וגם דנ"א וקטורי הטרולוגי בין תאים מאותו זן ובין תאים של שני זנים שונים הוכחה בעבר27,28. לאור ממצאים אלה, φBB-1 הוצע ככלי נוסף שיש לפתח לניתוח הביולוגיה המולקולרית של B. burgdorferi.
מטרת דו"ח זה היא לפרט שיטה לגרימה וטיהור של פאג φBB-1 מ- B. burgdorferi, כמו גם לספק פרוטוקול לביצוע בדיקת התמרה בין שיבוטים של B. burgdorferi ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

החדרת דנ"א זר לתוך הספירוכטה Borrelia burgdorferi הושגה כמעט אך ורק על ידי טרנספורמציה באמצעות אלקטרופורציה. לתהליך זה יש יעילות נמוכה יותר באופן ניכר במחלת ליים ספירוצ'ט בהשוואה לחיידקים גראם שליליים אחרים, המאופיינים טוב יותר. אחוזי ההצלחה של הטרנספורמציה תלויים מאוד בכך שיש כמויות מרוכזות של דנ"א באיכות גבוהה מרקעים ספציפיים וכפופים לשונות משמעותית מזן לזן. אמצעים חלופיים להחדרת דנ"א זר (כלומר, וקטורים של מעבורת, כתבים פלואורסצנטיים וסמני עמידות לאנטיביוטיקה) לתוך B. burgdorferi יכולים להיות תוספת חשובה לחימוש של כלים שימושיים למניפולציה גנטית של ספירוכט מחלת ליים. בקטריופאג' הוכר היטב כמנגנונים טבעיים לתנועת דנ"א בין חיידקים בתהליך שנקרא טרנסדוקציה. במחקר זה פותחה שיטה לשימוש בפאג' הבורליאלי φBB-1 הנמצא בכל מקום כדי להמיר דנ"א בין תאי B. burgdorferi מרקע גנטי זהה ושונה. הדנ"א המתמר כולל גם דנ"א בורליאלי וגם דנ"א הטרולוגי בצורה של וקטורים קטנים. הדגמה זו מציעה שימוש אפשרי בהתמרה בתיווך פאגים כהשלמה לאלקטרופורציה למניפולציה הגנטית של מחלת ליים ספירוכט. דו"ח זה מתאר שיטות לאינדוקציה וטיהור של פאג φBB-1 מ - B. burgdorferi, השימוש בפאג זה במבחני טרנסדוקציה, ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

השימוש בבקטריופאג' כדי להעביר דנ"א בין זנים של B. burgdorferi הניתנים לשינוי בקלות רבה יותר או שיבוטים שהם סרבנים לאלקטרו-טרנספורמציה מייצג כלי נוסף להמשך החקירה המולקולרית של הגורמים המשפיעים על מחלת ליים. ניתן לשנות את בדיקת ההתמרה המתוארת כאן לפי הצורך כדי להקל על תנועת הדנ"א בין כל שיבו?...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

היכולת של בקטריופאג' להעביר דנ"א בין תאי חיידקים הופכת אותם לכלים יעילים למניפולציה גנטית של החיידקים המארחים שלהם. מוצגת כאן מתודולוגיה לגרום, לשקם ולהשתמש ב-φBB-1, בקטריופאג' של בורליה בורגדורפרי, כדי להמיר דנ"א הטרולוגי בין זנים שונים של ספירוצ'טה של מחלת ליים.

מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מתאר כלי חשוב נוסף לניתוח הביולוגיה המולקולרית של סוכן מחלת ליים Borrelia burgdorferi. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי באמצעות התמרת פאגים, היא מספקת שיטה חלופית להחדרת DNA ב Borrelia burgdorferi ללא צורך ביישום של פולס חשמלי, כמו אלקטרופורציה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנה נוספת על המנגנונים המולקולריים המשמשים את Borrelia burgdorferi כדי להתמיד במחזור האנזוטי שלה ובסופו של דבר לגרום למחלת ליים בבני אדם.כדי להתחיל, לחסן 150 מיקרוליטרים של שיבוט Borrelia burgdorferi המתאים לתוך 15 מיליליטר של BSK בצינורות צנטריפוגה חרוטית סטרילית סגורה היטב עבור פרוטוקול הטרנסדוקציה. לאחר מכן, השלימו את המדיום עם הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה או שילוב של אנטיביוטיקה לבחירה ותחזוקה של דנ"א הטרולוגי בתוך שיבוט Borrelia burgdorferi ודגירה של הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס. לאחר שהתרבות גדלה, צנטריפוגה את נפח התרבות המתאים ב 6, 000 G במשך 10 דקות.לאחר פירוק הסופרנטנט, יש להשעות את הכדור בארבעה מיליליטר ב-BSK טרי ולהעביר את הדגימה לצינור הסטרילי הקטן ביותר שקיים כדי להחזיק את הדגימה עם שטח ראש מינימלי. לאחר מכן, הוסיפו את הכמות המתאימה של חומר משרה לריכוז המומלץ בהתבסס על נפח תרבית של ארבעה מיליליטר כדי לגרום לייצור פאגים, כסו את הצינור בחוזקה וערבבו היטב. לדגום את הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות.לאחר מכן, העבר את הדגימה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפוגה המדגם ב 6, 000 G במשך 10 דקות. לאחר decanting supernatant, להשעות את כדור התא ב 15 מיליליטר של BSK.השלימו את התרבית המוכנה עם ריכוז האנטיביוטיקה המתאים המתואר בכתב היד, תוך דגירה של הדגימה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס למשך 72 עד 96 שעות. כדי להכין פתרונות למשקעי PEG, הכינו 500 מיליליטר של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנות, 500 מיליליטר של 40% PEG, ו-100 מיליליטר של מדיום השעיה כמתואר בכתב היד. כדי לעקר, יש לקרר את התמיסה באופן אוטומטי, לקרר לפני השימוש ולאחסן את טמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס.עבור משקעי PEG של פאג מהתורם Borrelia burgdorferi שיבוט, לאחר 72 עד 96 שעות של דגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מפרקים את הסופר-נאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר ומשליכים את כדור התא. הוסיפו נתרן כלורי בעל חמש טוחנות לריכוז סופי של טוחנת אחת.לאחר ערבוב טוב, רוק בעדינות בטמפרטורת החדר במשך שעה. צנטריפוגה דגימות ב 8, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר פירוק הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר כפי שהוכח קודם לכן, הוסיפו תמיסת 40%PEG-8000 לסופרנטנט לריכוז סופי של 10% ערבבו היטב והניחו על הקרח למשך יותר משעה, עד ללילה.צנטריפוגה לדגימות ב 8, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כפי שהוכח קודם לכן. השליכו את הסופר-נטנט והסירו כמה שיותר נוזלים עודפים מבלי לאבד כדור, המכיל את חלקיקי הפאגים. יש לתלות את הכדור בנפח מינימלי של מדיום התרחיף באמצעות מדיום התרחיף כדי לשטוף את דופן הבקבוק ולאסוף חלקיקי פאגים פוטנציאליים.טפלו בדגימת הפאגים המשוחזרת בנפח שווה של כלורופורם בהתבסס על נפח ההדחה. מערבבים היטב את הדגימה צנטריפוגה ב 8, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את השכבה המימית לצינור נקי, תוך הימנעות מכל שכבות הממשק העבות.לאחר קביעת הנפח שהתאושש, לאחר הטיפול הראשון בכלורופורם, שוב לטפל בדגימה עם כמות של כלורופורם שווה ל 10% מנפח זה. העבירו את השכבה המימית לצינור נקי תוך הקפדה על הימנעות מהממשק או מהשכבות האורגניות. השתמש בפאג מיד או אחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הכנת תרבויות Borrelia burgdorferi שישמשו כמקבל במבחני התמרה כפי שהוכח קודם לכן, צנטריפוגה את נפח התרבות ב 6, 000 G במשך 10 דקות. דקנט את הסופר-נטנט והושיע את הכדור ב-14.5 מיליליטר של BSK טרי. הוסף פחות או שווה ל-500 מיקרוליטרים של דגימת פאג'ים משופעת PEG לתרבית השיבוט של המקבל.לאחר ערבוב טוב, לדגור ב 33 מעלות צלזיוס במשך 72 עד 96 שעות. בצע את בחירת המתמרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר ערבוב עם פאג מזורז PEG כמתואר בכתב היד. בהתאם לרקע של השיבוט של הנמען, בדוק כי המושבות מופיעות בתוך agarose על לוחות הבחירה לאחר 10 עד 21 ימים של דגירה.בחרו לפחות 5 עד 10 מושבות שגדלות על הצלחת בנוכחות שתי האנטיביוטיקות באמצעות פיפטה בורוסיליקט 5.75 אינץ' מכותנה מעוקרת ולחסן אותן ל-1.5 מיליליטר של BSK עם האנטיביוטיקה המתאימה. הגברת ה-PCR של הגנים בוצעה ב-10 מהשיבוטים המקודדים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין. ניתן להגביר את גן העמידות לקנאמיצין מהתורם c1673 ומהטרנסדוקטים הפוטנציאליים, אך לא מהמקבל c1706.באופן דומה, ניתן להגביר את גן העמידות לגנטמיצין מהמקבל c1706 ומהמתמרים הפוטנציאליים אך לא מהתורם, המייצגים אירועי טרנסדוקציה. כדי להדגים כי קלטת ההתנגדות לקנאמיצין הותמרה על ידי 5BB1 מהתורם למקבל. הרקע של המתמרים נקבע באמצעות סמנים ספציפיים לזן.השיבוט c1673 והרקע CA-112A מקודדים אמפליקונים ספציפיים ארבע, חמש ושש, ואילו c1706, בעל רקע B31 בעל מעבר גבוה, לא. באופן דומה, המתמרים 1 ו-2 היו חסרים אמפליקונים ארבע, חמש ושש, מה שמוכיח כי לשיבוטים יש את הרקע c1706 ורכשו את גן העמידות לקנאמיצין מ-c1673. עבור משקעי PEG של פאגים, בצע את כל השלבים בזהירות כדי למקסם את תפוקת הפאגים ולטפל בפאג המחודש ביסודיות עם כלורופורם כדי להסיר כמה שיותר מזהמי PEG ותרבית מדיה לפני השימוש והאחסון של פאגים.לאחר שבדיקת ההתמרה בוצעה בהצלחה והמתמר אומת, שיבוטים אלה זמינים לענות על השאלות הדורשות בורליה בורגדורפרי מהונדסת גנטית. יש לקוות שפיתוח טכניקה זו יאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות גנטיות בזני בורליה בורגדורפרי, שעבורם קשה כיום להכניס דנ"א באמצעות אלקטרופורציה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...