Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Forfatteren ønsker å takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskusjon og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for biomedisinsk vitenskap og fakultetets forskningsstipendier til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.

Alle eksperimenter ved bruk av rekombinante DNA- og BSL-2-organismer ble gjennomgått og godkjent av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.
1. Forberedelse av B. burgdorferi-kultur for produksjon av φBB-1
<ol><li>Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium supplert med 6,6% varmeinaktivert normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponentene oppført i tabell 1 i 900 ml vann, justerer pH til 7,6 ved bruk av <st...

Bruken av transduksjon kan representere en metode for å overvinne minst noen av de biologiske og tekniske barrierer knyttet til elektrotransformasjonen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte vert (ikke-prophage) DNA mellom bakterieceller ved enten generalisert eller spesialisert transduksjon 22,23,24,49,50.<sup class="xr...

Utviklingen av verktøy for genetisk manipulering av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilført umåtelig verdi til forståelsen av Lyme-sykdommens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et uvanlig komplekst genom som består av et lite lineært kromosom og både lineære og sirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtap, intragen omorganisering (bevegelse av gener fra ett plasmid til et annet i samme organisme) og horisontal genoverføring (HGT, bevegelse av DNA mellom to organismer) har gitt opphav til en svimlende mengde genetisk heterogenitet blant B. burgdorferi (for eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotypene (eller "stammer") er alle medlemmer av samme art, men har genetiske forskjeller som påvirker deres evne til å overføre til og infisere forskjellige pattedyrverter 8,9,10,11. I denne rapporten vil begrepet "stamme" bli brukt til å referere til B. burgdorferi med en bestemt naturlig avledet genetisk bakgrunn; Begrepet "klone" vil bli brukt til å referere til en stamme som er genetisk modifisert for et bestemt formål eller som følge av eksperimentell manipulasjon.
Den molekylære verktøykassen som er tilgjengelig for bruk i B. burgdorferi inkluderer valgbare markører, genreportere, skyttelvektorer, transposon mutagenese, induserbare promotorer og motvalgbare markører (for en gjennomgang, se Drektrah og Samuels12). Effektiv bruk av disse metodene krever kunstig innføring av heterologt (utenlandsk) DNA i en B. burgdorferi-stamme av interesse. I B. burgdorferi oppnås innføringen av heterologt DNA nesten utelukkende via elektroporering, en metode som benytter en puls av elektrisitet for å gjøre en bakteriemembran forbigående gjennomtrengelig for små biter av DNA introdusert i media1. Flertallet av cellene (estimert til å være ≥99,5%) blir drept av pulsen, men de resterende cellene har en høy frekvens for å beholde det heterologe DNA13. Selv om det anses å være blant de mest effektive metodene for å introdusere DNA i bakterier, er hyppigheten av elektroporering i B. burgdorferi svært lav (fra 1 transformant i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Barrierene for å oppnå høyere transformasjonsfrekvenser ser ut til å være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for vellykket elektroporering av B. burgdorferi inkluderer både mengden DNA (>10 μg) som er nødvendig og kravet om at spiroketene skal være i nøyaktig riktig vekstfase (midt i loggen, mellom 2 × 10 7 celler · ml − 1 og 7 × 107 celler · ml −1) ved fremstilling av elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierene kan imidlertid være lettere å overvinne enn de biologiske barrierene.
Lyme sykdom forskere erkjenner at B. burgdorferi kloner kan deles inn i to brede kategorier med hensyn til deres evne til å bli manipulert genetisk13,14. Høy passasje, laboratorietilpassede isolater blir ofte lett transformert, men har vanligvis mistet plasmidene som er essensielle for smittsomhet, oppfører seg på en fysiologisk avvikende måte, og er ikke i stand til å infisere en pattedyrvert eller vedvare i en kryssvektor12,13. Selv om disse klonene har vært nyttige for å dissekere molekylærbiologien til spiroketen i laboratoriet, er de av liten verdi for å studere spirocheten innenfor den biologiske konteksten av den enzootiske syklusen. Lavpassasje smittsomme isolater oppfører seg derimot på en fysiologisk måte som reflekterer en smittsom tilstand og kan fullføre den smittsomme syklusen, men er vanligvis gjenstridig mot innføringen av heterologt DNA og er derfor vanskelig å manipulere for studie12,13. Vanskeligheten med å transformere isolater med lav passasje er relatert til minst to forskjellige faktorer: (i) isolater med lav passasje klumper seg ofte tett sammen, spesielt under de høye tetthetsforholdene som kreves for elektroporering, og blokkerer dermed mange celler fra enten full påføring av den elektriske ladningen eller tilgang til DNA i media13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for minst to forskjellige plasmidbårne restriksjonsmodifikasjonssystemer (R-M) som kan gå tapt i høypassasjeisolater14,16. R-M-systemer har utviklet seg slik at bakterier kan gjenkjenne og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere studier i B. burgdorferi vist at transformasjonseffektiviteten øker når kilden til DNA er B. burgdorferi i stedet for Escherichia coli13,16. Dessverre er anskaffelse av den nødvendige høye konsentrasjonen av DNA for elektroporering fra B. burgdorferi et dyrt og tidkrevende prospekt. En annen potensiell bekymring ved elektroporating og valg av lavpassasjeisolater er at prosessen ser ut til å favorisere transformanter som har mistet det kritiske virulensassosierte plasmidet, lp2514,18,19; dermed kan selve handlingen med genetisk manipulering av lavpassasje B. burgdorferi-isolater via elektroporering velge for kloner som ikke er egnet for biologisk relevant analyse innenfor den enzootiske syklusen20. Gitt disse problemene, kan et system der heterologt DNA kan elektrotransformeres til høypassasje B. burgdorferi-kloner og deretter overføres til lavpassasje smittsomme isolater ved en annen metode enn elektroporering, være et velkomment tillegg til den voksende samlingen av molekylære verktøy tilgjengelig for bruk i Lyme-sykdommen spirochete.
I tillegg til transformasjon (opptak av nakent DNA), er det to andre mekanismer hvor bakterier regelmessig tar opp heterologt DNA: konjugering, som er utveksling av DNA mellom bakterier i direkte fysisk kontakt med hverandre, og transduksjon, som er utveksling av DNA mediert av en bakteriofag21. Faktisk har bakteriofagens evne til å formidle HGT blitt brukt som et eksperimentelt verktøy for å dissekere de molekylære prosessene i en rekke bakterielle systemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturlig kompetent for opptak av nakent DNA, og det er lite bevis på at B. burgdorferi koder for apparatet som er nødvendig for å fremme vellykket konjugering. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifisering og foreløpig karakterisering av φBB-1, en temperert bakteriofag av B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider funnet i B. burgdorferi25; Medlemmene av denne familien har fått betegnelsen CP32s. I samsvar med en rolle for φBB-1 i å delta i HGT blant B. burgdorferi-stammer, rapporterte Stevenson og medarbeidere en identisk cp32 funnet i to stammer med ellers forskjellige cp32s, noe som tyder på en nylig deling av denne cp32 mellom disse to stammene, sannsynligvis via transduksjon29. Det er også tegn på signifikant rekombinasjon via HGT blant cp32s i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig har evnen til φBB-1 til å transdusere både cp32s og heterolog shuttle vector DNA mellom celler av samme stamme og mellom celler av to forskjellige stammer blitt demonstrert tidligere27,28. Gitt disse funnene har φBB-1 blitt foreslått som et annet verktøy som skal utvikles for disseksjon av molekylærbiologien til B. burgdorferi.
Målet med denne rapporten er å detaljere en metode for å indusere og rense φBB-1 fra B. burgdorferi, samt gi en protokoll for å utføre en transduksjonsanalyse mellom B. burgdorferi-kloner og velge og screene potensielle transduktanter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Innføring av fremmed DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nesten utelukkende blitt oppnådd ved transformasjon ved hjelp av elektroporering. Denne prosessen har betydelig lavere effektivitet i Lyme sykdom spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserte Gram-negative bakterier. Suksessraten for transformasjon er svært avhengig av å ha konsentrerte mengder DNA av høy kvalitet fra spesifikke bakgrunner og er gjenstand for betydelig belastning-til-belastningsvariabilitet. Alternative midler for å introdusere utenlandsk DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerende reportere og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kan være et viktig tillegg til armamentarium av nyttige verktøy for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Bakteriofag har blitt anerkjent som naturlige mekanismer for bevegelse av DNA blant bakterier i en prosess som kalles transduksjon. I denne studien er det utviklet en metode for å bruke den allestedsnærværende borreliale fagen φBB-1 for å transdusere DNA mellom B. burgdorferi-celler med både samme og forskjellig genetisk bakgrunn. Det transduserte DNA inkluderer både borrelialt DNA og heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denne demonstrasjonen antyder en potensiell bruk av fagmediert transduksjon som et supplement til elektroporering for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Denne rapporten beskriver metoder for induksjon og rensing av φBB-1 fra B. burgdorferi, bruk av denne fagen i transduksjonsanalyser, og valg og screening av potensielle transduktanter.

Bruken av bakteriofag for å flytte DNA mellom lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner som er gjenstridige mot elektrotransformasjon, representerer et annet verktøy for fortsatt molekylær undersøkelse av determinanter for Lyme-sykdommen. Transduksjonsanalysen beskrevet her kan modifiseres etter behov for å lette bevegelsen av DNA mellom kloner av interesse ved bruk av enten ett eller to antibiotika for valg av potensielle transduktanter. Transduksjonen av både profag-DNA og heterologe <e...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Bakteriofagens evne til å flytte DNA mellom bakterieceller gjør dem til effektive verktøy for genetisk manipulering av deres bakterielle verter. Presentert her er en metode for å indusere, gjenopprette og bruke φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, for å transdusere heterologt DNA mellom forskjellige stammer av Lyme-sykdommen spirochete.

Fagmediert genetisk manipulasjon av Lyme-sykdommen Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Denne protokollen er viktig fordi den beskriver et annet viktig verktøy for å dissekere molekylærbiologien til Lyme-sykdomsmidlet Borrelia burgdorferi. Den største fordelen med denne teknikken er at ved å bruke fagtransduksjon, gir den en alternativ metode for å introdusere DNA i Borrelia burgdorferi uten å kreve påføring av en elektrisk puls, som ved elektroporering. Denne metoden kan brukes til å gi ytterligere innsikt i de molekylære mekanismene som brukes av Borrelia burgdorferi for å vedvare i sin enzootiske syklus og til slutt forårsake Lyme-sykdom hos mennesker.For å begynne, inokulere 150 mikroliter av den aktuelle Borrelia burgdorferi-klonen til 15 milliliter BSK i tett kappede sterile koniske sentrifugerør for transduksjonsprotokollen. Deretter supplerer du mediet med riktig konsentrasjon av antibiotika eller en kombinasjon av antibiotika for valg og vedlikehold av heterologt DNA i Borrelia burgdorferi-klonen og inkuberer prøven ved 33 grader Celsius. Etter at kulturen har vokst opp, sentrifuger riktig volum kultur på 6.000 G i 10 minutter.Etter dekantering av supernatanten, resuspend pelleten i fire milliliter ved fersk BSK og overfør prøven til det minste sterile røret som er tilgjengelig for å holde prøven med minimal hodeplass. Deretter legger du til riktig mengde induserende middel til den anbefalte konsentrasjonen basert på et kulturvolum på fire milliliter for å indusere fagproduksjon, kappe røret tett og blandes grundig. Inkuber prøven ved 33 grader Celsius i to til fire timer.Overfør deretter prøven til et 15 milliliter sentrifugerør. Sentrifuger prøven ved 6.000 G i 10 minutter. Etter dekantering av supernatanten, resuspend cellepelleten i 15 milliliter BSK.Suppler den tilberedte kulturen med riktig antibiotikakonsentrasjon beskrevet i manuskriptet, mens du inkuberer prøven ved 33 grader Celsius i 72 til 96 timer. For å forberede løsninger for PEG-nedbør, lag 500 ml fem molar natriumklorid, 500 milliliter 40% PEG og 100 ml suspensjonsmedium som beskrevet i manuskriptet. For å sterilisere, autoklav løsningen, avkjøl før bruk, og oppbevar romtemperatur eller fire grader Celsius.For PEG-nedbør av fra donoren Borrelia burgdorferi-klonen, etter 72 til 96 timers inkubasjon, sentrifuger prøvene ved 8.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dekanter supernatanten i et rent, 50 milliliter konisk rør og kast cellepelleten. Tilsett fem-molar natriumklorid til en endelig konsentrasjon av en molar.Etter å ha blandet godt, rock forsiktig ved romtemperatur i en time. Sentrifuger prøvene ved 8.000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha dekantert supernatanten i et rent 50 milliliter konisk rør som vist tidligere, tilsett 40% PEG-8000-løsningen til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 10% Bland godt og sett på is i mer enn en time, opp til over natten.Sentrifuge til prøvene ved 8.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius som vist tidligere. Kast supernatanten og fjern så mye overflødig væske som mulig uten å miste pellet, som inneholder fagpartiklene. Resuspend pelleten i et minimalt volum suspensjonsmedium ved hjelp av suspensjonsmediet for å vaske ned siden av flasken og samle eventuelle fagpartikler.Behandle den gjenvunnede fagprøven med et likt volum kloroform basert på volumet av resuspendering. Bland prøven godt og sentrifuge ved 8.000 G i 10 minutter. Fjern deretter det vandige laget til et rent rør, og unngå noen av de tykke grensesnittlagene.Etter å ha bestemt volumet som er gjenopprettet, etter den første kloroformbehandlingen, behandle prøven igjen med en mengde kloroform som tilsvarer 10% av dette volumet. Overfør det vandige laget til et rent rør mens du er forsiktig med å unngå noe av grensesnittet eller organiske lag. Bruk fagen umiddelbart eller oppbevar den ved fire grader Celsius.Etter å ha forberedt Borrelia burgdorferi-kulturer som skal brukes som mottaker i transduksjonsanalyser som vist tidligere, sentrifugerer volumet av kultur ved 6.000 G i 10 minutter. Dekanter supernatanten og resuspendere pelleten i 14,5 milliliter fersk BSK. Tilsett mindre enn eller lik 500 mikroliter PEG-utfelt fagprøve til kulturen til mottakerklonen.Etter å ha blandet godt, inkuber ved 33 grader Celsius i 72 til 96 timer. Utføre valg av transduksjonsmidler ved fastfasebelegg etter blanding med PEG-utfelt som beskrevet i manuskriptet. Avhengig av bakgrunnen til mottakerklonen, må du kontrollere at koloniene vises i agarose på utvalgsplatene etter 10 til 21 dagers inkubasjon.Velg minst 5 til 10 kolonier som vokser på platen i nærvær av begge antibiotika ved bruk av sterilisert bomullsplugget 5,75 tommer borosilikatpipette og inokuler dem til 1,5 milliliter BSK med riktig antibiotika. PCR-amplifiseringen av genene ble utført på 10 av klonene som koder for kanamycin- og gentamycinresistens. Kanamycinresistensgenet kan forsterkes fra donor c1673 og potensielle transduktanter, men ikke mottaker c1706.På samme måte kan gentamycinresistensgenet forsterkes fra mottaker c1706 og de potensielle transduktantene, men ikke donoren, noe som representerer transduksjonshendelser. For å demonstrere at kanamycinresistenskassetten ble transdusert av 5BB1 fra giver til mottaker. Bakgrunnen til transduktantene ble bestemt ved hjelp av belastningsspesifikke markører.C1673-klonen og CA-112A-bakgrunnen koder for spesifikke amplikoner fire, fem og seks, mens c1706, som har en B31-bakgrunn med høy passasje, ikke gjør det. På samme måte manglet transduktantene en og to amplikoner fire, fem og seks, noe som viser at klonene har c1706-bakgrunnen og har fått kanamycinresistensgenet fra c1673. For PEG-utfelling av, utfør alle trinnene nøye for å maksimere utbyttet av og behandle den resuspenderte fagen grundig med kloroform for å fjerne så mye PEG og kulturmedieforurensninger som mulig før fagbruk og lagring.Når transduksjonsanalysen er vellykket utført og transduksjonen verifisert, er disse klonene tilgjengelige for å svare på spørsmålene som krever genetisk modifisert Borrelia burgdorferi. Utviklingen av denne teknikken vil forhåpentligvis tillate forskere å genetisk manipulere Borrelia burgdorferi-stammer som innføring av DNA via elektroporering for tiden er vanskelig.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulering i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer for Funksjonell genom analyse av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduksjon T-hjelpeceller som genetisk tilnærming å studere mekanismer kontrollere sine Differensiering og funksjon

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel røde blodceller Lysis Metode for opprettelse av B lymfoblastoide cellelinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinne Prøvetaking metode for påvisning av humant Norovirus på overflater

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...