Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Автор хотел бы поблагодарить Шону Рид, Д. Скотта Сэмюэлса и Патрика Секора за их полезную дискуссию и Вареона (Пэм) Чонвиравонга за их техническую помощь. Эта работа была поддержана Департаментом биомедицинских наук и исследовательскими грантами факультета Кристиану Х. Эггерсу из Школы наук о здоровье в Университете Куиннипиак.

Все эксперименты с использованием рекомбинантной ДНК и организмов BSL-2 были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Куиннипиак.
1. Подготовка культуры Б. бургдорфери для получения φBB-1
<ol><li>Приготовить среду Барб...

Использование трансдукции может представлять собой один из методов преодоления, по меньшей мере, некоторых биологических и технических барьеров, связанных с электротрансформацией B. burgdorferi 1,4,13,37. Во многих сист?...

Разработка инструментов для генетической манипуляции спирохетальной бактерией Borrelia burgdorferi добавила неизмеримую ценность пониманию природы болезни Лайма 1,2,3,4. B. burgdorferi имеет необычно сложный геном, состоящий из небольшой линейной хромосомы и как линейных, так и круговых плазмид 5,6. Спонтанная потеря плазмид, внутригенная перестройка (перемещение генов из одной плазмиды в другую в пределах одного организма) и горизонтальный перенос генов (HGT, движение ДНК между двумя организмами) привели к головокружительному количеству генетической гетерогенности среди B. burgdorferi (например, см. Schutzer et al.7). Полученные генотипы (или «штаммы») являются членами одного и того же вида, но имеют генетические различия, которые влияют на их способность передавать и заражать разных хозяев млекопитающих 8,9,10,11. В настоящем докладе термин «штамм» будет использоваться для обозначения B. burgdorferi с особым естественным генетическим фоном; термин «клон» будет использоваться для обозначения штамма, который был генетически модифицирован для определенной цели или в результате экспериментальных манипуляций.
Молекулярный набор инструментов, доступный для использования у B. burgdorferi, включает выбираемые маркеры, генные репортеры, векторы челноков, транспозонный мутагенез, индуцируемые промоторы и контризбираемые маркеры (для обзора см. Drektrah and Samuels12). Эффективное использование этих методологий требует искусственного введения гетерологичной (чужеродной) ДНК в интересующий штамм B. burgdorferi. У B. burgdorferi введение гетерологичной ДНК достигается почти исключительно с помощью электропорации, метода, который использует импульс электричества, чтобы сделать бактериальную мембрану временно проницаемой для небольших кусочков ДНК, введенных в среду1. Большинство клеток (по оценкам, ≥99,5%) погибают от пульса, но остальные клетки имеют высокую частоту удержания гетерологичной ДНК13. Хотя это считается одним из наиболее высокоэффективных методов введения ДНК в бактерии, частота электропорации в B. burgdorferi очень низкая (в пределах от 1 трансформанта в 5 × 104 до 5 × 106 клеток)13. Барьеры для достижения более высоких частот трансформации, по-видимому, являются как техническими, так и биологическими. Технические барьеры для успешной электропорации B. burgdorferi включают как необходимое количество ДНК (>10 мкг), так и требование к спирохетам находиться именно в правильной фазе роста (средняя бревна, от 2 × 107 клеток·мл−1 до 7 × 107 клеток·мл−1) при получении электрокомпетентных ячеек12,13. Однако эти технические барьеры может быть легче преодолеть, чем биологические барьеры.
Исследователи болезни Лайма признают, что клоны B. burgdorferi можно разделить на две широкие категории в отношении их способности к генетическому манипулированию13,14. Высокопроходимые, адаптированные к лабораторным исследованиям изоляты часто легко трансформируются, но обычно теряют плазмиды, необходимые для инфекционности, ведут себя физиологически аберрантно и не способны заражать хозяина млекопитающих или сохраняться в клещевом векторе12,13. Хотя эти клоны были полезны для препарирования молекулярной биологии спирохеты в лаборатории, они не имеют большой ценности для изучения спирохеты в биологическом контексте энзоотического цикла. С другой стороны, низкопроходимые инфекционные изоляты ведут себя физиологически, отражая инфекционное состояние, и могут завершать инфекционный цикл, но обычно непокорны к введению гетерологичной ДНК и, следовательно, трудно манипулировать для исследования12,13. Трудность преобразования изолятов низкого прохода связана, по меньшей мере, с двумя различными факторами: (i) изоляты низкого прохода часто плотно слипаются вместе, особенно в условиях высокой плотности, необходимых для электропорации, тем самым блокируя многие клетки либо от полного применения электрического заряда, либо от доступа к ДНК в среде13,15; и ii) B. burgdorferi кодирует по меньшей мере две различные плазмидные системы рестрикции-модификации (R-M), которые могут быть потеряны в изолятах с высоким проходом14,16. Системы R-M эволюционировали, чтобы позволить бактериям распознавать и устранять чужеродную ДНК17. Действительно, несколько исследований b. burgdorferi показали, что эффективность трансформации увеличивается, когда источником ДНК является B. burgdorferi, а не Escherichia coli13,16. К сожалению, приобретение необходимой высокой концентрации ДНК для электропорации у B. burgdorferi является дорогостоящей и трудоемкой перспективой. Другая потенциальная проблема при электропорации и выборе изолятов низкого прохода заключается в том, что процесс, по-видимому, благоприятствует трансформантам, которые потеряли критическую плазмиду, связанную с вирулентностью, lp25 14,18,19; таким образом, сам акт генетического манипулирования низкопроходными изолятами B. burgdorferi посредством электропорации может отбирать клоны, которые не подходят для биологически значимого анализа в энзоотическом цикле20. Учитывая эти проблемы, система, в которой гетерологичная ДНК может быть электротрансформирована в высокопроходные клоны B. burgdorferi, а затем перенесена в инфекционные изоляты низкого прохода методом, отличным от электропорации, может быть желанным дополнением к растущей коллекции молекулярных инструментов, доступных для использования в спирохете болезни Лайма.
Помимо трансформации (поглощения голой ДНК), существуют два других механизма, с помощью которых бактерии регулярно поглощают гетерологичную ДНК: конъюгация, которая представляет собой обмен ДНК между бактериями, находящимися в прямом физическом контакте друг с другом, и трансдукция, которая представляет собой обмен ДНК, опосредованный бактериофагом21. Действительно, способность бактериофага опосредуть HGT была использована в качестве экспериментального инструмента для препарирования молекулярных процессов в ряде бактериальных систем 22,23,24. B. burgdorferi от природы не компетентен для поглощения голой ДНК, и существует мало доказательств того, что B. burgdorferi кодирует аппарат, необходимый для успешного спряжения. Однако в предыдущих докладах описывалась идентификация и предварительная характеристика φBB-1, умеренного бактериофага B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 упаковывает семейство плазмид размером 30 кб, обнаруженных в B. burgdorferi25; члены этого семейства были обозначены cp32s. В соответствии с ролью φBB-1 в участии в HGT среди штаммов B. burgdorferi, Stevenson et al. сообщили об идентичном cp32, обнаруженном в двух штаммах с разрозненными cp32s, предполагая недавнее разделение этого cp32 между этими двумя штаммами, вероятно, через трансдукцию29. Есть также доказательства значительной рекомбинации через HGT среди cp32s в относительно стабильном геноме 30,31,32,33. Наконец, способность φBB-1 трансдуцировать как cp32s, так и гетерологичную челночную векторную ДНК между клетками одного и того же штамма и между клетками двух разных штаммов была продемонстрирована ранее27,28. Учитывая эти результаты, φBB-1 был предложен в качестве еще одного инструмента, который будет разработан для вскрытия молекулярной биологии B. burgdorferi.
Целью настоящего доклада является детализация метода индуцирования и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, а также предоставление протокола для выполнения трансдукционного анализа между клонами B. burgdorferi и отбора и скрининга потенциальных трансдуктантов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Введение чужеродной ДНК в спирохету Borrelia burgdorferi было почти исключительно осуществлено путем трансформации с использованием электропорации. Этот процесс имеет заметно более низкую эффективность спирохеты болезни Лайма по сравнению с другими, лучше охарактеризованными грамотрицательными бактериями. Скорость успеха трансформации в значительной степени зависит от наличия концентрированных количеств высококачественной ДНК из определенных фонов и подвержена значительной изменчивости от штамма к штамму. Альтернативные средства для введения чужеродной ДНК (т.е. челночных векторов, флуоресцентных репортеров и маркеров устойчивости к антибиотикам) в B. burgdorferi могут стать важным дополнением к арсеналу полезных инструментов для генетической манипуляции спирохетой болезни Лайма. Бактериофаги были хорошо известны как естественные механизмы движения ДНК среди бактерий в процессе, называемом трансдукцией. В этом исследовании был разработан метод использования вездесущего боррелиального фага φBB-1 для трансдукции ДНК между клетками B. burgdorferi как одного, так и разного генетического происхождения. Трансдуцированная ДНК включает в себя как боррелиальную ДНК, так и гетерологичную ДНК в виде небольших челночных векторов. Эта демонстрация предполагает потенциальное использование фаговой трансдукции в качестве дополнения к электропорации для генетических манипуляций со спирохетой болезни Лайма. В настоящем отчете описываются методы индукции и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, использование этого фага в анализах трансдукции, а также отбор и скрининг потенциальных трансдуктантов.

Использование бактериофага для перемещения ДНК между более легко трансформируемыми штаммами B. burgdorferi или клонами, которые непокорны электротрансформации, представляет собой еще один инструмент для продолжения молекулярного исследования детерминант болезни Лайма. Трансдукцион...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Способность бактериофага перемещать ДНК между бактериальными клетками делает их эффективными инструментами для генетических манипуляций с их бактериальными хозяевами. Здесь представлена методология индуцирования, восстановления и использования φBB-1, бактериофага Borrelia burgdorferi, для трансдукции гетерологичной ДНК между различными штаммами спирохеты болезни Лайма.

Фаго-опосредованная генетическая манипуляция болезнью Лайма Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Этот протокол важен, потому что он описывает еще один важный инструмент для препарирования молекулярной биологии агента болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Основным преимуществом этой методики является то, что, используя фаговую трансдукцию, она обеспечивает альтернативный метод введения ДНК в Borrelia burgdorferi, не требуя применения электрического импульса, как при электропорации. Этот метод может быть использован для обеспечения дальнейшего понимания молекулярных механизмов, используемых Borrelia burgdorferi, чтобы сохраниться в своем энзоотическом цикле и в конечном итоге вызвать болезнь Лайма у людей.Для начала инокулируют 150 микролитров соответствующего клона Borrelia burgdorferi в 15 миллилитров BSK в плотно закрытых стерильных конических центрифужных трубках для протокола трансдукции. Затем дополните среду соответствующей концентрацией антибиотиков или комбинацией антибиотиков для отбора и поддержания гетерологичной ДНК в клоне Borrelia burgdorferi и инкубируйте образец при 33 градусах Цельсия. После того, как культура вырастет, центрифугируют соответствующий объем культуры в 6000 г в течение 10 минут.После декантирования супернатанта повторно суспендируйте гранулу в четыре миллилитра в свежем BSK и перенесите образец в самую маленькую стерильную трубку, доступную для хранения образца с минимальным пространством головки. Затем добавьте соответствующее количество индуцирующего агента к рекомендуемой концентрации, основанной на объеме культуры в четыре миллилитра, чтобы индуцировать производство фага, плотно закройте трубку и тщательно перемешайте. Инкубируйте образец при температуре 33 градуса Цельсия в течение двух-четырех часов.Затем перенесите образец в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте образец при 6 000 G в течение 10 минут. После декантирования супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в 15 миллилитрах БСК.Дополнить подготовленную культуру соответствующей концентрацией антибиотиков, описанной в рукописи, при этом инкубируя образец при температуре 33 градуса Цельсия в течение 72-96 часов. Для приготовления растворов для осаждения ПЭГ готовят 500 миллилитров пятимолярного хлорида натрия, 500 миллилитров 40% ПЭГ и 100 миллилитров суспензионной среды, как описано в рукописи. Для стерилизации раствор автоклавируйте, охладите перед использованием и храните комнатную температуру или четыре градуса Цельсия.Для ПЭГ-осаждения фага из донорского клона Borrelia burgdorferi после 72-96 часов инкубации центрифугируют образцы при 8 000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Декантируйте супернатант в чистую 50-миллилитровую коническую трубку и утилизируйте гранулу ячейки. Добавьте пятимолярный хлорид натрия до конечной концентрации одного моляра.После хорошего перемешивания аккуратно помешивать при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 8 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После декантирования супернатанта в чистую 50-миллилитровую коническую трубку, как показано ранее, добавьте 40%-ный раствор ПЭГ-8000 к супернатанту до конечной концентрации 10%Хорошо перемешайте и положите на лед более одного часа, вплоть до ночи.Центрифуга к образцам при 8 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, как было продемонстрировано ранее. Выбросьте супернатант и удалите как можно больше лишней жидкости без потери гранул, которые содержат частицы фага. Повторно суспендируйте гранулу в минимальном объеме суспензионной среды, используя суспензионную среду, чтобы промыть боковую часть бутылки и собрать любые потенциальные фаговые частицы.Обработайте восстановленный образец фага равным объемом хлороформа на основе объема повторного суспензии. Хорошо перемешайте образец и центрифугируйте при 8 000 г в течение 10 минут. Затем удалите водный слой в чистую трубку, избегая любого из толстых слоев интерфейса.После определения извлеченного объема, после первой обработки хлороформом, снова обработайте образец количеством хлороформа, равным 10% от этого объема. Перенесите водный слой в чистую трубку, соблюдая осторожность, чтобы избежать любого из интерфейсных или органических слоев. Используйте фаг немедленно или храните его при четырех градусах Цельсия.После подготовки культур Borrelia burgdorferi для использования в качестве реципиента в трансдукционных анализах, как показано ранее, центрифугируют объем культуры в 6000 г в течение 10 минут. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 14,5 миллилитрах свежего BSK. Добавьте менее или равно 500 микролитрам осажденного ПЭГ образца фага в культуру клона-реципиента.После хорошего перемешивания инкубировать при 33 градусах Цельсия в течение 72-96 часов. Выполняют отбор трансдуктантов твердофазным покрытием после смешивания с ПЭГ-осажденным фагом, как описано в рукописи. В зависимости от фона клона-реципиента, проверьте, появляются ли колонии в агарозе на селекционных пластинах после 10-21 дня инкубации.Соберите по крайней мере от 5 до 10 колоний, которые растут на пластине в присутствии обоих антибиотиков, используя стерилизованную хлопковую 5,75-дюймовую боросиликатную пипетку и привите их в 1,5 миллилитра BSK соответствующим антибиотиком. ПЦР-амплификация генов проводилась на 10 клонах, кодирующих резистентность к канамицину и гентамицину. Ген резистентности к канамицину может быть амплифицирован донором c1673 и потенциальными трансдуктантами, но не реципиентом c1706.Аналогичным образом, ген устойчивости к гентамицину может быть амплифицирован от реципиента c1706 и потенциальных трансдуктантов, но не донора, представляя события трансдукции. Чтобы продемонстрировать, что кассета с резистентностью к канамицину была трансдуцирована 5BB1 от донора к реципиенту. Фон трансдуктантов определяли с помощью специфических для штаммов маркеров.Клон c1673 и фон CA-112A кодируют определенные ампликоны четыре, пять и шесть, тогда как c1706, который имеет высокий проходной фон B31, этого не делает. Аналогичным образом, в трансдукантах один и два отсутствовали ампликоны четыре, пять и шесть, демонстрируя, что клоны имеют фон c1706 и приобрели ген устойчивости к канамицину от c1673. Для осаждения фагов пэг пэг тщательно выполните все шаги, чтобы максимизировать выход фага и тщательно обработайте повторно суспендированный фаг хлороформом, чтобы удалить как можно больше загрязняющих веществ ПЭГ и культуральной среды перед использованием и хранением фагов.После того, как анализ трансдукции был успешно выполнен и трансдуктант проверен, эти клоны доступны для ответа на вопросы, которые требуют генетически модифицированного Borrelia burgdorferi. Мы надеемся, что разработка этого метода позволит исследователям генетически манипулировать штаммами Borrelia burgdorferi, для которых введение ДНК посредством электропорации в настоящее время затруднено.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Методы для быстрой передачи и локализации патогенов Болезнь Лайма В Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Генетические манипуляции<em&gt; Δku80</em&gt; Штаммов для функционального геномного анализа<em&gt; Токсоплазма</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Кормление клещей на животных для передачи и ксенодиагностика в Лайма исследования заболеваний

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...