Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Författaren vill tacka Shawna Reed, D. Scott Samuels och Patrick Secor för deras användbara diskussion och Vareeon (Pam) Chonweerawong för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av institutionen för biomedicinska vetenskaper och fakultetsforskningsbidrag till Christian H. Eggers från School of Health Sciences vid Quinnipiac University.

Alla experiment med rekombinant DNA och BSL-2-organismer granskades och godkändes av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.
1. Beredning av B. burgdorferi-kulturen för produktion av φBB-1
<ol><li>Förbered Barbour-Stoenner-Kelly medium kompletterat med 6,6% värmeinaktiverat normalt kaninserum (BSK)15. För 1 liter 1x BSK, kombinera de komponenter som anges i tabell 1 i 900 ml vatten, justera pH-värdet till 7,6 med <stro...

Användningen av transduktion kan representera en metod för att övervinna åtminstone några av de biologiska och tekniska hinder som är förknippade med elektrotransformationen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I många system kan bakteriofag flytta värd-DNA (icke-prophage) mellan bakterieceller genom antingen generaliserad eller specialiserad transduktion 22,23...

Utvecklingen av verktyg för genmanipulation av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tillfört ett omätbart värde till förståelsen av borrelians natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har ett ovanligt komplext genom som består av en liten linjär kromosom och både linjära och cirkulära plasmider 5,6. Spontan plasmidförlust, intragen omläggning (rörelse av gener från en plasmid till en annan inom samma organism) och horisontell genöverföring (HGT, DNA-rörelsen mellan två organismer) har gett upphov till en svindlande mängd genetisk heterogenitet bland B. burgdorferi (för ett exempel, se Schutzer et al.7). De resulterande genotyperna (eller "stammarna") är alla medlemmar av samma art men har genetiska skillnader som påverkar deras förmåga att överföra till och infektera olika däggdjursvärdar 8,9,10,11. I denna rapport kommer termen "stam" att användas för att hänvisa till B. burgdorferi med en särskild naturligt härledd genetisk bakgrund; Termen "klon" kommer att användas för att hänvisa till en stam som har modifierats genetiskt för ett visst ändamål eller som ett resultat av experimentell manipulation.
Den molekylära verktygslådan som är tillgänglig för användning i B. burgdorferi inkluderar valbara markörer, genreportrar, skyttelvektorer, transposonmutagenes, inducerbara promotorer och motvalbara markörer (för en recension, se Drektrah och Samuels12). En effektiv användning av dessa metoder kräver ett artificiellt införande av heterologt (främmande) DNA i en B. burgdorferi-stam av intresse. I B. burgdorferi uppnås införandet av heterologt DNA nästan uteslutande via elektroporering, en metod som använder en puls av elektricitet för att göra ett bakteriemembran övergående permeabelt för små bitar av DNA som införs i mediet1. Majoriteten av cellerna (uppskattas till ≥99,5%) dödas av pulsen, men de återstående cellerna har en hög frekvens för att behålla det heterologa DNA13. Även om det anses vara bland de mest effektiva metoderna för att införa DNA i bakterier, är frekvensen av elektroporering i B. burgdorferi mycket låg (allt från 1 transformant i 5 × 104 till 5 × 106 celler)13. Hindren för att uppnå högre omvandlingsfrekvenser verkar vara både tekniska och biologiska. Tekniska hinder för framgångsrik elektroporering av B. burgdorferi inkluderar både mängden DNA (>10 μg) som är nödvändig och kravet på att spiroketerna ska vara i exakt rätt tillväxtfas (mitten av log, mellan 2 × 10 7 celler ·ml−1 och 7 × 107 celler·ml−1) vid framställning av elektrokompetenta celler 12,13. Dessa tekniska hinder kan dock vara lättare att övervinna än de biologiska hindren.
Borreliaforskare inser att B. burgdorferi-kloner kan delas in i två breda kategorier med avseende på deras förmåga att manipuleras genetiskt13,14. Högpassage, laboratorieanpassade isolat omvandlas ofta lätt men har vanligtvis förlorat de plasmider som är väsentliga för smittsamhet, beter sig på ett fysiologiskt avvikande sätt och kan inte infektera en däggdjursvärd eller kvarstå inom en fästingvektor12,13. Även om dessa kloner har varit användbara för att dissekera spiroketens molekylärbiologi inom laboratoriet, är de av litet värde för att studera spiroketen inom det biologiska sammanhanget för den enzootiska cykeln. Infektiösa isolat med låg passage, å andra sidan, beter sig på ett fysiologiskt sätt som återspeglar ett infektiöst tillstånd och kan slutföra den infektiösa cykeln men är vanligtvis motsträviga mot införandet av heterologt DNA och är därför svåra att manipulera för studie12,13. Svårigheten att omvandla lågpassageisolat är relaterad till minst två olika faktorer: (i) lågpassageisolat som ofta tätt klumpar ihop sig, särskilt under de förhållanden med hög densitet som krävs för elektroporering, vilket blockerar många celler från antingen fullständig applicering av den elektriska laddningen eller tillgång till DNA i mediet13,15; och (ii) B. burgdorferi kodar för minst två olika plasmidburna restriktionsmodifieringssystem (R-M) som kan gå förlorade i högpassageisolat14,16. R-M-system har utvecklats för att tillåta bakterier att känna igen och eliminera främmande DNA17. Faktum är att flera studier i B. burgdorferi har visat att omvandlingseffektiviteten ökar när källan till DNA är B. burgdorferi snarare än Escherichia coli13,16. Tyvärr är det en dyr och tidskrävande möjlighet att förvärva den nödvändiga höga koncentrationen av DNA för elektroporering från B. burgdorferi. Ett annat potentiellt problem vid elektroporering och val av lågpassageisolat är att processen verkar gynna transformanter som har förlorat den kritiska virulensassocierade plasmiden, lp2514,18,19; således kan själva handlingen att genetiskt manipulera lågpassage B. burgdorferi-isolat via elektroporering välja för kloner som inte är lämpliga för biologiskt relevant analys inom den enzootiska cykeln20. Med tanke på dessa problem kan ett system där heterologt DNA kan elektrotransformeras till B. burgdorferi-kloner med hög passage och sedan överföras till lågpassage-infektiösa isolat med en annan metod än elektroporering vara ett välkommet tillskott till den växande samlingen av molekylära verktyg som är tillgängliga för användning i borreliaspiroketen.
Förutom transformation (upptaget av naket DNA) finns det två andra mekanismer genom vilka bakterier regelbundet tar upp heterologt DNA: konjugering, vilket är utbyte av DNA mellan bakterier i direkt fysisk kontakt med varandra och transduktion, vilket är utbytet av DNA medierat av en bakteriofag21. Faktum är att bakteriofagens förmåga att förmedla HGT har använts som ett experimentellt verktyg för att dissekera de molekylära processerna inom ett antal bakteriesystem22,23,24. B. burgdorferi är inte naturligt kompetent för upptag av naket DNA, och det finns få bevis för att B. burgdorferi kodar för den apparat som är nödvändig för att främja framgångsrik konjugering. Tidigare rapporter har dock beskrivit identifieringen och den preliminära karakteriseringen av φBB-1, en tempererad bakteriofag av B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 förpackar en familj av 30 kb plasmider som finns inom B. burgdorferi25; Medlemmarna i denna familj har betecknats CP32S. I överensstämmelse med en roll för φBB-1 i att delta i HGT bland B. burgdorferi-stammar, rapporterade Stevenson et al. en identisk cp32 som hittades i två stammar med annars olika cp32s, vilket tyder på en ny delning av denna cp32 mellan dessa två stammar, troligen via transduktion29. Det finns också tecken på signifikant rekombination via HGT bland cp32:orna i ett annars relativt stabilt genom30,31,32,33. Slutligen har förmågan hos φBB-1 att transducera både cp32s och heterologt skyttelvektor-DNA mellan celler av samma stam och mellan celler av två olika stammar visats tidigare27,28. Med tanke på dessa resultat har φBB-1 föreslagits som ett annat verktyg som ska utvecklas för dissektion av molekylärbiologin hos B. burgdorferi.
Målet med denna rapport är att beskriva en metod för att inducera och rena φBB-1 från B. burgdorferi, samt tillhandahålla ett protokoll för att utföra en transduktionsanalys mellan B. burgdorferi-kloner och välja och screena potentiella transduktanter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Införandet av främmande DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nästan uteslutande åstadkommits genom transformation med hjälp av elektroporation. Denna process har särskilt lägre effektivitet i borrelia spirokete i förhållande till andra, bättre karakteriserade gramnegativa bakterier. Graden av framgång för transformation är mycket beroende av att ha koncentrerade mängder av högkvalitativt DNA från specifika bakgrunder och är föremål för betydande stam-till-stam-variation. Alternativa medel för att införa främmande DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerande reportrar och markörer för antibiotikaresistens) i B. burgdorferi kan vara ett viktigt tillskott till beväpningen av användbara verktyg för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Bakteriofag har varit välkända som naturliga mekanismer för rörelse av DNA bland bakterier i en process som kallas transduktion. I denna studie har en metod utvecklats för att använda den allestädes närvarande borreliala fagen φBB-1 för att transducera DNA mellan B. burgdorferi-celler med både samma och olika genetiska bakgrunder. Det transducerade DNA:t innefattar både borreliellt DNA och heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denna demonstration tyder på en potentiell användning av fagmedierad transduktion som ett komplement till elektroporering för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Denna rapport beskriver metoder för induktion och rening av φBB-1 från B. burgdorferi, användningen av denna i transduktionsanalyser och urval och screening av potentiella transduktanter.

Användningen av bakteriofag för att flytta DNA mellan mer lätt transformerbara B. burgdorferi-stammar eller kloner som är motsträviga mot elektrotransformation representerar ett annat verktyg för fortsatt molekylär undersökning av determinanterna för borrelia. Den transduktionsanalys som beskrivs häri kan modifieras efter behov för att underlätta förflyttningen av DNA mellan alla kloner av intresse med användning av antingen ett eller två antibiotika för val av potentiella transduktanter. Transdu...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Bakteriofagens förmåga att flytta DNA mellan bakterieceller gör dem till effektiva verktyg för genetisk manipulation av deras bakterievärdar. Här presenteras en metod för att inducera, återhämta sig och använda φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, för att transducera heterologt DNA mellan olika stammar av borrelia spiroket.

Fagmedierad genmanipulation av borrelia Spirokete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det beskriver ett annat viktigt verktyg för att dissekera molekylärbiologin hos borreliamedlet Borrelia burgdorferi. Den största fördelen med denna teknik är att genom att använda fagtransduktion ger den en alternativ metod för att införa DNA i Borrelia burgdorferi utan att kräva applicering av en elektrisk puls, som vid elektroporering. Denna metod kan användas för att ge ytterligare inblick i de molekylära mekanismer som Borrelia burgdorferi använder för att kvarstå i sin enzootiska cykel och i slutändan orsaka borrelia hos människor.Till att börja med inokulera 150 mikroliter av lämplig Borrelia burgdorferi-klon i 15 ml BSK i tätt täckta sterila koniska centrifugrör för transduktionsprotokollet. Komplettera sedan mediet med lämplig koncentration av antibiotika eller en kombination av antibiotika för selektion och underhåll av heterologt DNA i Borrelia burgdorferi-klonen och inkubera provet vid 33 grader Celsius. Efter att kulturen har vuxit upp, centrifugera lämplig volym kultur vid 6 000 G i 10 minuter.Efter dekantering av supernatanten, återsuspendera pelleten i fyra milliliter vid färsk BSK och överför provet till det minsta sterila röret som finns tillgängligt för att hålla provet med minimalt huvudutrymme. Tillsätt sedan lämplig mängd inducerande medel till den rekommenderade koncentrationen baserat på en odlingsvolym på fyra milliliter för att inducera fagproduktion, täck röret tätt och blanda noggrant. Inkubera provet vid 33 grader Celsius i två till fyra timmar.Överför sedan provet till ett 15-ml centrifugrör. Centrifugera provet vid 6 000 g i 10 minuter. Efter dekantering av supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 15 ml BSK.Komplettera den beredda kulturen med lämplig antibiotikakoncentration som beskrivs i manuskriptet, medan provet inkuberas vid 33 grader Celsius i 72 till 96 timmar. För att förbereda lösningar för PEG-utfällning, förbered 500 ml femmolär natriumklorid, 500 ml 40% PEG och 100 ml suspensionsmedium som beskrivs i manuskriptet. För att sterilisera, autoklavera lösningen, svalna före användning och förvara rumstemperatur eller fyra grader Celsius.För PEG-utfällning av från donatorn Borrelia burgdorferi-klonen, efter 72 till 96 timmars inkubation, centrifugera proverna vid 8 000 G i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Dekantera supernatanten i ett rent, 50-milliliter koniskt rör och kassera cellpelleten. Tillsätt femmolär natriumklorid till en slutlig koncentration av en molar.Efter blandning väl, gunga försiktigt vid rumstemperatur i en timme. Centrifugera proverna vid 8 000 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Efter dekantering av supernatanten till ett rent 50-ml koniskt rör som visats tidigare, tillsätt 40% PEG-8000-lösning till supernatanten till en slutlig koncentration av 10% Blanda väl och sätt på is i mer än en timme, upp till över natten.Centrifugera till proverna vid 8 000 G i 20 minuter vid fyra grader Celsius som visats tidigare. Kassera supernatanten och ta bort så mycket överskottsvätska som möjligt utan att förlora någon pellet, som innehåller fagpartiklarna. Återsuspendera pelleten i en minimal volym suspensionsmedium med hjälp av suspensionsmediet för att tvätta ner flaskans sida och samla eventuella fagpartiklar.Behandla det återvunna fagprovet med en lika stor volym kloroform baserat på volymen av resuspension. Blanda provet väl och centrifugera vid 8 000 g i 10 minuter. Ta sedan bort det vattenhaltiga skiktet till ett rent rör och undvik något av de tjocka gränssnittsskikten.Efter bestämning av den återvunna volymen, efter den första kloroformbehandlingen, behandla provet igen med en mängd kloroform som är lika med 10% av den volymen. Överför det vattenhaltiga skiktet till ett rent rör samtidigt som du är noga med att undvika något av gränssnittet eller organiska lager. Använd fagen omedelbart eller förvara den vid fyra grader Celsius.Efter beredning av Borrelia burgdorferi-kulturer som ska användas som mottagare i transduktionsanalyser som visats tidigare, centrifugera odlingsvolymen vid 6 000 G i 10 minuter. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 14,5 ml färsk BSK. Tillsätt mindre än eller lika med 500 mikroliter PEG-utfällt fagprov till mottagarklonens kultur.Efter blandning väl, inkubera vid 33 grader Celsius i 72 till 96 timmar. Utför valet av transduktanter genom fastfasplätering efter blandning med PEG-utfälld enligt beskrivningen i manuskriptet. Beroende på mottagarklonens bakgrund, kontrollera att kolonierna förekommer i agarosen på urvalsplattorna efter 10 till 21 dagars inkubation.Välj minst 5 till 10 kolonier som växer på plattan i närvaro av båda antibiotika med steriliserad bomullspluggad 5,75-tums borosilikatpipett och inokulera dem i 1,5 ml BSK med lämpligt antibiotikum. PCR-förstärkningen av generna utfördes på 10 av klonerna som kodar för kanamycin- och gentamycinresistens. Kanamycinresistensgenen kunde förstärkas från donatorn c1673 och de potentiella transduktanterna men inte mottagaren c1706.På samma sätt kan gentamycinresistensgenen förstärkas från mottagaren c1706 och de potentiella transduktanterna men inte givaren, som representerar transduktionshändelser. Att visa att kanamycinresistenskassetten transducerades av 5BB1 från givaren till mottagaren. Transduktanternas bakgrund bestämdes med hjälp av töjningsspecifika markörer.C1673-klonen och CA-112A-bakgrunden kodar specifika amplikoner fyra, fem och sex, medan c1706, som har en B31-bakgrund med hög passage, inte gör det. På samma sätt saknade transduktanterna ett och två amplikonerna fyra, fem och sex, vilket visar att klonerna har c1706-bakgrunden och har förvärvat kanamycinresistensgenen från c1673. För PEG-utfällning av, utför alla steg noggrant för att maximera utbytet av och behandla den återsuspenderade fagen noggrant med kloroform för att avlägsna så mycket PEG- och odlingsmedieföroreningar som möjligt före faganvändning och lagring.När transduktionsanalysen har utförts framgångsrikt och transduktanten verifierats är dessa kloner sedan tillgängliga för att svara på de frågor som kräver genetiskt modifierad Borrelia burgdorferi. Utvecklingen av denna teknik kommer förhoppningsvis att göra det möjligt för forskare att genetiskt manipulera Borrelia burgdorferi-stammar för vilka införandet av DNA via elektroporering för närvarande är svårt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Metoder för snabb överföring och lokalisering av Borrelia Patogener Inom Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Utfodring av fästingar på djur för Transmission och Xenodiagnosis i Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduction av Helper T-celler som en genetisk strategi för att studera mekanismer som styr deras differentiering och funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel röda blodkroppar Lysis metod för upprättande av B lymfoblastoidcellinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Genknackning av CRISPR/Cas9 och cellsortering i makrofag och T-cellinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...