Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Yazar, yararlı tartışmaları için Shawna Reed, D. Scott Samuels ve Patrick Secor'a ve teknik yardımları için Vareeon (Pam) Chonweerawong'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler Bölümü ve Quinnipiac Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi'nden Christian H. Eggers'a fakülte araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

Rekombinant DNA ve BSL-2 organizmalarını kullanan tüm deneyler Quinnipiac Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. φBB-1 üretimi için B. burgdorferi kültürünün hazırlanması
<ol><li>Barbour-Stoenner-Kelly besiyerini% 6.6 ısıda inaktive edilmiş normal tavşan serumu (BSK) ile desteklenmiş olarak hazırlayın 15. 1 L 1x BSK için, Tablo 1'de listelenen bileşenleri 900...

Transdüksiyonun kullanımı, B. burgdorferi1,4,13,37'nin elektrotransformasyonu ile ilişkili biyolojik ve teknik engellerin en azından bir kısmının üstesinden gelmenin bir yöntemini temsil edebilir. Birçok sistemde, bakteriyofaj, konakçı (profaj olmayan) DNA'yı, genelleştirilmiş veya uzmanlaşmış transdüksiyon22,23,24,49,50<sup class=...

Spiroketal bakteri Borrelia burgdorferi'nin genetik manipülasyonu için araçların geliştirilmesi, Lymehastalığının 1,2,3,4 doğasının anlaşılmasına ölçülemez bir değer katmıştır. B. burgdorferi, küçük bir doğrusal kromozomdan ve hem doğrusal hem de dairesel plazmidlerden oluşan alışılmadık derecede karmaşık bir genoma sahiptir 5,6. Spontan plazmid kaybı, intragenik yeniden düzenleme (aynı organizma içinde genlerin bir plazmidden diğerine hareketi) ve yatay gen transferi (HGT, DNA'nın iki organizma arasındaki hareketi), B. burgdorferi arasında baş döndürücü miktarda genetik heterojenliğe yol açmıştır (örneğin, Schutzer ve ark.7'ye bakınız). Ortaya çıkan genotipler (veya "suşlar") aynı türün üyeleridir, ancak farklı memeli konakçılarına bulaşma ve enfekte etme yeteneklerini etkileyen genetik farklılıklara sahiptir 8,9,10,11. Bu raporda, "suş" terimi, doğal olarak türetilmiş belirli bir genetik geçmişe sahip B. burgdorferi'ye atıfta bulunmak için kullanılacaktır; "klon" terimi, belirli bir amaç için veya deneysel manipülasyonun bir sonucu olarak genetik olarak değiştirilmiş bir suşu ifade etmek için kullanılacaktır.
B. burgdorferi'de kullanılabilen moleküler araç kutusu, seçilebilir belirteçleri, gen muhabirlerini, mekik vektörlerini, transpozon mutagenezini, indüklenebilir promotörleri ve karşı seçilebilir belirteçleri içerir (bir inceleme için bkz. Drektrah ve Samuels12). Bu metodolojilerin etkili kullanımı, heterolog (yabancı) DNA'nın ilgilenilen bir B. burgdorferi suşuna yapay olarak sokulmasını gerektirir. B. burgdorferi'de, heterolog DNA'nın tanıtılması neredeyse tamamen elektroporasyon yoluyla elde edilir; bu, bir bakteri zarını ortama sokulan küçük DNA parçalarına geçici olarak geçirgen hale getirmek için bir elektrik darbesi kullanan bir yöntemdir1. Hücrelerin çoğunluğu (≥% 99.5) olduğu tahmin edilmektedir, ancak kalan hücreler heterolog DNA13'ü tutma sıklığı yüksektir. DNA'yı bakterilere sokmanın en etkili yöntemlerinden biri olarak kabul edilmesine rağmen, B. burgdorferi'ye elektroporasyon sıklığı çok düşüktür (5 × 104 ila 5 × 106 hücrede 1 dönüştürücü arasında değişmektedir)13. Daha yüksek dönüşüm frekanslarına ulaşmanın önündeki engeller hem teknik hem de biyolojik gibi görünmektedir. B. burgdorferi'nin başarılı elektroporasyonunun önündeki teknik engeller, elektroremetuar hücreleri hazırlarken hem gerekli olan DNA miktarını (>10 μg) hem de spiroketlerin tam olarak doğru büyüme aşamasında (orta log, 2 ila 10 7 hücre · mL-1 ve7 ×× 107 hücre · mL − 1) olma gereksinimini içerir12,13. Bununla birlikte, bu teknik engellerin üstesinden gelmek biyolojik engellerden daha kolay olabilir.
Lyme hastalığı araştırmacıları, B. burgdorferi klonlarının genetik olarak manipüle edilme yetenekleri açısından iki geniş kategoriye ayrılabileceğini kabul etmektedir13,14. Yüksek pasajlı, laboratuara uyarlanmış izolatlar genellikle kolayca dönüştürülür, ancak genellikle bulaşıcılık için gerekli olan plazmidleri kaybetmiş, fizyolojik olarak anormal bir şekilde davranmış ve bir memeli konağını enfekte edememiş veya bir kene vektörü12,13 içinde devam edememiştir. Bu klonlar, spiroketin moleküler biyolojisini laboratuarda incelemek için yararlı olsa da, spiroketi enzootik döngünün biyolojik bağlamında incelemek için çok az değere sahiptir. Öte yandan, düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlar, enfeksiyöz bir durumu yansıtan fizyolojik bir şekilde davranırlar ve enfeksiyöz döngüyü tamamlayabilirler, ancak genellikle heterolog DNA'nın girişine inatçıdır ve bu nedenle, çalışma12,13 için manipüle edilmesi zordur. Düşük pasajlı izolatların dönüştürülmesindeki zorluk, en az iki farklı faktörle ilgilidir: (i) düşük pasajlı izolatlar, özellikle elektroporasyon için gerekli olan yüksek yoğunluklu koşullar altında, genellikle sıkıca bir araya toplanır, böylece birçok hücrenin elektrik yükünün tam olarak uygulanmasını veya ortamdaki DNA'ya erişimini engeller13,15; ve (ii) B. burgdorferi, yüksek pasajlı izolatlarda kaybolabilecek en az iki farklı plazmid kaynaklı kısıtlama-modifikasyon (R-M) sistemini kodlar14,16. R-M sistemleri, bakterilerin yabancı DNA'yı tanımasına ve ortadan kaldırmasına izin verecek şekilde evrimleşmiştir17. Gerçekten de, B. burgdorferi'de yapılan birkaç çalışma, DNA'nın kaynağı Escherichia coli13,16 yerine B. burgdorferi olduğunda dönüşüm verimliliğinin arttığını göstermiştir. Ne yazık ki, B. burgdorferi'den elektroporasyon için gerekli yüksek konsantrasyonda DNA elde etmek pahalı ve zaman alıcı bir olasılıktır. Düşük pasajlı izolatların elektroporasyonu ve seçilmesi sırasında bir diğer potansiyel endişe, işlemin kritik virülansla ilişkili plazmidi kaybetmiş transformantları tercih ediyor gibi görünmesidir, lp2514,18,19; Bu nedenle, düşük pasajlı B. burgdorferi izolatlarını elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme eylemi, enzootik döngü20 içinde biyolojik olarak ilgili analizler için uygun olmayan klonları seçebilir. Bu sorunlar göz önüne alındığında, heterolog DNA'nın yüksek pasajlı B. burgdorferi klonlarına elektrotransforme edilebileceği ve daha sonra elektroporasyon dışında bir yöntemle düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlara aktarılabileceği bir sistem, Lyme hastalığı spiroketinde kullanılmak üzere mevcut moleküler araçların artan koleksiyonuna hoş bir katkı olabilir.
Transformasyona (çıplak DNA'nın alımı) ek olarak, bakterilerin düzenli olarak heterolog DNA'yı aldıkları iki mekanizma daha vardır: birbirleriyle doğrudan fiziksel temas halinde olan bakteriler arasındaki DNA değişimi olan konjugasyon ve bir bakteriyofaj21 tarafından aracılık edilen DNA değişimi olan transdüksiyon. Gerçekten de, bakteriyofajın HGT'ye aracılık etme yeteneği, bir dizi bakteri sistemi içindeki moleküler süreçleri incelemek için deneysel bir araç olarak kullanılmıştır22,23,24. B. burgdorferi, çıplak DNA'nın alımı için doğal olarak yetkin değildir ve B. burgdorferi'nin başarılı konjugasyonu teşvik etmek için gerekli aparatı kodladığına dair çok az kanıt vardır. Bununla birlikte, önceki raporlar, B. burgdorferi25,26,27,28'in ılıman bir bakteriyofajı olan φBB-1'in tanımlanmasını ve ön karakterizasyonunu tanımlamıştır. φBB-1, B. burgdorferi25'te bulunan 30 kb'lik bir plazmid ailesini paketler; bu ailenin üyeleri cp32s olarak belirlenmiştir. B. burgdorferi suşları arasında HGT'ye katılmada φBB-1'in rolüyle tutarlı olarak, Stevenson ve ark., aksi takdirde farklı cp32'lere sahip iki suşta bulunan özdeş bir cp32 bildirmiştir, bu da bu cp32'nin bu iki suş arasında, muhtemelen transdüksiyon29 yoluyla yakın zamanda paylaşıldığını düşündürmektedir. Ayrıca, aksi takdirde nispeten kararlı bir genom 30,31,32,33'te cp32'ler arasında HGT yoluyla önemli rekombinasyon kanıtı vardır. Son olarak, φBB-1'in hem cp32'leri hem de heterolog mekik vektör DNA'sını aynı suşun hücreleri arasında ve iki farklı suşun hücreleri arasında dönüştürme kabiliyeti daha önce27,28 gösterilmiştir. Bu bulgular göz önüne alındığında, φBB-1, B. burgdorferi'nin moleküler biyolojisinin diseksiyonu için geliştirilecek başka bir araç olarak önerilmiştir.
Bu raporun amacı, B. burgdorferi'den faj φBB-1'i indüklemek ve saflaştırmak için bir yöntemi detaylandırmak, ayrıca B. burgdorferi klonları arasında bir transdüksiyon testi yapmak ve potansiyel transdüktörleri seçmek ve taramak için bir protokol sağlamaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Spiroket Borrelia burgdorferi'ye yabancı DNA'nın sokulması, neredeyse sadece elektroporasyon kullanılarak transformasyonla gerçekleştirilmiştir. Bu işlem, Lyme hastalığı spiroketinde diğer, daha iyi karakterize edilmiş Gram-negatif bakterilere göre önemli ölçüde daha düşük verimliliğe sahiptir. Transformasyonun başarı oranı, belirli geçmişlerden konsantre miktarlarda yüksek kaliteli DNA'ya sahip olmaya büyük ölçüde bağlıdır ve önemli gerinim-gerinim değişkenliğine tabidir. B. burgdorferi'ye yabancı DNA'yı (yani mekik vektörleri, floresan muhabirleri ve antibiyotik direnci belirteçleri) sokmak için alternatif yollar, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için yararlı araçların silahlandırılmasına önemli bir katkı olabilir. Bakteriyofaj, transdüksiyon adı verilen bir süreçte DNA'nın bakteriler arasındaki hareketi için doğal mekanizmalar olarak iyi tanınmıştır. Bu çalışmada, hem aynı hem de farklı genetik geçmişlere sahip B. burgdorferi hücreleri arasında DNA'yı dönüştürmek için her yerde bulunan borrelial faj φBB-1'i kullanmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Dönüştürülmüş DNA, hem borrelial DNA'yı hem de küçük mekik vektörleri şeklinde heterolog DNA'yı içerir. Bu gösterim, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için elektroporasyonun bir tamamlayıcısı olarak faj aracılı transdüksiyonun potansiyel bir kullanımını önermektedir. Bu rapor, B. burgdorferi'den faj φBB-1'in indüksiyonu ve saflaştırılması, bu fajın transdüksiyon tahlillerinde kullanımı ve potansiyel transdüktanların seçimi ve taranması için yöntemleri açıklamaktadır.

DNA'yı daha kolay dönüştürülebilir B. burgdorferi suşları veya elektrotransformasyona inatçı klonlar arasında hareket ettirmek için bakteriyofajın kullanılması, Lyme hastalığının belirleyicilerinin devam eden moleküler araştırması için başka bir aracı temsil eder. Burada tarif edilen transdüksiyon testi, potansiyel transdüktanların seçimi için bir veya iki antibiyotik kullanılarak DNA'nın ilgili klonlar arasındaki hareketini kolaylaştırmak için gerektiğinde değiştirilebili...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Bakteriyofajın DNA'yı bakteri hücreleri arasında hareket ettirme yeteneği, onları bakteriyel konakçılarının genetik manipülasyonu için etkili araçlar haline getirir. Burada, Borrelia burgdorferi'nin bir bakteriyofajı olan φBB-1'i, Lyme hastalığı spiroketinin farklı suşları arasında heterolog DNA'yı dönüştürmek için indüklemek, iyileştirmek ve kullanmak için bir metodoloji sunulmaktadır.

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Bu protokol önemlidir, çünkü Lyme hastalığı ajanı Borrelia burgdorferi'nin moleküler biyolojisini incelemek için başka bir önemli aracı tanımlar. Bu tekniğin temel avantajı, faj transdüksiyonunu kullanarak, elektroporasyonda olduğu gibi bir elektrik darbesinin uygulanmasına gerek kalmadan Borrelia burgdorferi'ye DNA sokmak için alternatif bir yöntem sağlamasıdır. Bu yöntem, Borrelia burgdorferi tarafından enzootik döngüsünde devam etmek ve sonuçta insanlarda Lyme hastalığına neden olmak için kullanılan moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılabilir.Başlamak için, transdüksiyon protokolü için sıkıca kapatılmış steril konik santrifüj tüplerinde uygun Borrelia burgdorferi klonunun 150 mikrolitresini 15 mililitre BSK'ya aşılayın. Daha sonra, ortamı Borrelia burgdorferi klonu içindeki heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için uygun antibiyotik konsantrasyonu veya bir antibiyotik kombinasyonu ile destekleyin ve numuneyi 33 santigrat derecede inkübe edin. Kültür büyüdükten sonra, uygun kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin.Süper natantı boşalttıktan sonra, peleti taze BSK'da dört mililitre halinde yeniden askıya alın ve numuneyi minimum kafa boşluğuyla tutmak için mevcut en küçük steril tüpe aktarın. Daha sonra, faj üretimini indüklemek, tüpü sıkıca kapatmak ve iyice karıştırmak için dört mililitrelik bir kültür hacmine dayanarak önerilen konsantrasyona uygun miktarda indükleyici madde ekleyin. Numuneyi iki ila dört saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin.Ardından, numuneyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj yapın. Süper natantı boşalttıktan sonra, hücre peletini 15 mililitre BSK'da yeniden askıya alın.Hazırlanan kültürü, makalede açıklanan uygun antibiyotik konsantrasyonu ile tamamlarken, numuneyi 72 ila 96 saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin. PEG çökeltmesi için çözeltiler hazırlamak için, makalede açıklandığı gibi 500 mililitre beş molar sodyum klorür, 500 mililitre% 40 PEG ve 100 mililitre süspansiyon ortamı hazırlayın. Sterilize etmek için, çözeltiyi otoklavın, kullanmadan önce soğutun ve oda sıcaklığını veya dört santigrat derece depolayın.Donör Borrelia burgdorferi klonundan fajın PEG çökeltilmesi için, 72 ila 96 saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı temiz, 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın ve hücre peletini atın. Bir azı dişinin son konsantrasyonuna beş molar sodyum klorür ekleyin.İyice karıştırdıktan sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı daha önce gösterildiği gibi temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe boşalttıktan sonra,% 40 PEG-8000 çözeltisini% 10'luk son bir konsantrasyona ekleyin İyice karıştırın ve bir saatten fazla bir süre, bir geceye kadar buz üzerinde ayarlayın.Daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de numunelere santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve faj parçacıklarını içeren herhangi bir pelet kaybetmeden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. Şişenin yan tarafını yıkamak ve potansiyel faj parçacıklarını toplamak için süspansiyon ortamını kullanarak peleti minimum hacimli bir süspansiyon ortamında yeniden askıya alın.Geri kazanılan faj numunesini, resüsitasyon hacmine bağlı olarak eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Numuneyi iyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj yapın. Ardından, kalın arayüz katmanlarından herhangi birini önleyerek sulu tabakayı temiz bir tüpe çıkarın.Geri kazanılan hacmi belirledikten sonra, ilk kloroform işlemini takiben, numuneyi tekrar bu hacmin% 10'una eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Sulu tabakayı temiz bir tüpe aktarın ve arayüz veya organik katmanlardan herhangi birini önlemeye dikkat edin. Fajı hemen kullanın veya dört santigrat derecede saklayın.Borrelia burgdorferi kültürlerini, daha önce gösterildiği gibi transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere hazırladıktan sonra, kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 14.5 mililitre taze BSK'da yeniden askıya alın. Alıcı klonun kültürüne 500 mikrolitre PEG çökeltilmiş faj örneğinden daha az veya buna eşit ekleyin.İyice karıştırdıktan sonra, 72 ila 96 saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin. Transdüktanların seçimini, makalede açıklandığı gibi PEG çökeltilmiş faj ile karıştırdıktan sonra katı faz kaplama ile gerçekleştirin. Alıcı klonun arka planına bağlı olarak, kolonilerin 10 ila 21 günlük inkübasyondan sonra seçim plakalarındaki agaroz içinde görünüp görünmediğini kontrol edin.Sterilize pamuk tıkaçlı 5.75 inç borosilikat pipet kullanarak her iki antibiyotik varlığında plakada yetişen en az 5 ila 10 koloni seçin ve bunları uygun antibiyotik ile 1.5 mililitre BSK'ya aşılayın. Genlerin PCR amplifikasyonu, kanamisin ve gentamisin direncini kodlayan klonların 10'unda gerçekleştirildi. Kanamisin direnç geni, donör c1673 ve potansiyel transdüktanlardan güçlendirilebilir, ancak alıcı c1706'dan değil.Benzer şekilde, gentamisin direnç geni, alıcı c1706'dan ve potansiyel transdüktan, transdüksiyon olaylarını temsil eden donörden değil, güçlendirilebilir. Kanamisin direnç kasetinin 5BB1 tarafından donörden alıcıya dönüştürüldüğünü göstermek. Transdüktanların arka planı, gerinime özgü belirteçler kullanılarak belirlendi.C1673 klonu ve CA-112A arka planı, belirli amplikonları dört, beş ve altıyı kodlarken, yüksek geçişli B31 arka planına sahip olan c1706 kodlamaz. Benzer şekilde, bir ve iki transdüktanlar dört, beş ve altı amplikonlarını eksikti, bu da klonların c1706 arka planına sahip olduğunu ve kanamisin direnç genini c1673'ten edindiğini gösterdi. Fajın PEG çökeltilmesi için, faj verimini en üst düzeye çıkarmak için tüm adımları dikkatlice uygulayın ve faj kullanımı ve depolanmasından önce mümkün olduğunca fazla PEG ve kültür ortamı kirleticisini gidermek için yeniden askıya alınmış fajı kloroform ile iyice işlemden geçirin.Transdüksiyon testi başarıyla gerçekleştirildikten ve transdüktan doğrulandıktan sonra, bu klonlar genetiği değiştirilmiş Borrelia burgdorferi gerektiren soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların DNA'nın elektroporasyon yoluyla tanıtılmasının şu anda zor olduğu Borrelia burgdorferi suşlarını genetik olarak manipüle etmelerine izin verecektir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...