Name: quantifying the antifungal activity of peptides against candida albicans
Uploaded: 2023-01-13T14:00:00
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この研究は、国立衛生研究所(R03DE029270、T32AI089621B)、国立科学財団(CBET 1511718)、教育省(GAANN-P200A180093)、およびメリーランド大学クロスキャンパスシード助成金の支援を受けました。

メリーランド大学カレッジパーク校の施設バイオセーフティ委員会(IBC)から、このプロトコル(PN 274)での C.アルビカンス との作業について承認が得られました。 C.アルビカンス 株SC5314( 材料の表を参照)を本研究では使用しました。しかしながら、任意の他の株も使用され得る。
1.緩衝液、滅菌水、培地の調製
<ol><li>pH 7.4で滅菌済み...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+Development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Arya, N. R., Rafiq, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis.">Candidiasis.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>de Oliveira Santos, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+infections+and+therapeutic+strategies:+Mechanisms+of+action+for+traditional+and+alternative+agents.">Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).</li><li>Espinel-Ingroff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+resistance+to+antifungal+agents:+Yeasts+and+filamentous+fungi.">Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi.</a> Revista Iberoamericana de Micolog&#237;a. 25 (2), 101-106 (2008).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+strategies+of+amphotericin+B+for+invasive+fungal+infections.">Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).</li><li>Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-interacting+antifungal+peptides.">Membrane-interacting antifungal peptides.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).</li><li>Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+Classification,+design,+application+and+research+progress+in+multiple+fields.">Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).</li><li>Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+proteins:+From+nature's+reservoir+to+the+laboratory+and+beyond.">Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).</li><li>Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+as+therapeutic+agents:+Opportunities+and+challenges.">Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).</li><li>Lei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptides+and+their+potential+clinical+applications.">The antimicrobial peptides and their potential clinical applications.</a> American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).</li><li>Mercer, D. K., O'Neil, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inspiration:+Antifungal+peptides+and+other+immunotherapeutics+from+the+host+immune+response.">Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).</li><li>Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+An+update+on+classifications+and+databases.">Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).</li><li>Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B-+and+fluconazole-resistant+Candida+spp.,+Aspergillus+fumigatus,+and+other+newly+emerging+pathogenic+fungi+are+susceptible+to+basic+antifungal+peptides.">Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).</li><li>Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecropins,+antibacterial+peptides+from+insects+and+mammals,+are+potently+fungicidal+against+Candida+albicans.">Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).</li><li>do Nascimento Dias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+antimicrobial+peptides+ToAP2+and+NDBP-5.7+against+Candida+albicans+planktonic+and+biofilm+cells.">Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells.</a> Scientific Reports. 10, 10327 (2020).</li><li>Ikonomova, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histatin+5+modifications+on+antifungal+activity+and+kinetics+of+proteolysis.">Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis.</a> Protein Science. 29, 480-493 (2020).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , (2008).</li><li>Lupetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+activities+of+human+lactoferrin+peptides+derived+from+the+N+terminus.">Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).</li><li>Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+action+mechanism+of+histatin+5-halocidin+hybrid+peptides+against+Candida+ssp.">Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp.</a> PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).</li><li>den Hertog, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+effects+of+two+antimicrobial+peptides:+histatin+5+causes+small+membrane+defects,+but+LL-37+causes+massive+disruption+of+the+cell+membrane.">Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane.</a> Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).</li><li>Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+improved+variants+of+the+antifungal+peptide+histatin+5+with+reduced+susceptibility+to+Candida+albicans+secreted+aspartic+proteases+and+enhanced+antimicrobial+potency.">Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency.</a> The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).</li><li>Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5+variant+reduces+Candida+albicans+biofilm+viability+and+inhibits+biofilm+formation.">Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation.</a> Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).</li><li>Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+charge+and+hydrophobicity+in+translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+albicans+cells.">Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells.</a> AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).</li><li>Gong, Z., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+fungal+pathogens.">Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens.</a> Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).</li><li>Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: <a target="_blank" href="https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf">https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf</a> (2022)</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antifungal+susceptibility+variables+for+a+semiautomated+methodology.">Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).</li><li>Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+mode+of+action+of+synthetic+peptides+derived+from+the+tick+OsDef2+defensin.">Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin.</a> Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).</li><li>Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis-mediated+vacuolar+accumulation+of+the+human+ApoE+apolipoprotein-derived+ApoEdpL-W+antimicrobial+peptide+contributes+to+its+antifungal+activity+in+Candida+albicans.">Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).</li><li>Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+of+the+hemolytic+and+fungicidal+activities+of+cationic+antimicrobial+peptides.">A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides.</a> FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).</li><li>Kerenga, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-tolerant+antifungal+and+antibacterial+activities+of+the+corn+defensin+ZmD32.">Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).</li><li>Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+and+salinity+on+the+antimicrobial+properties+of+clavanins.">Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins.</a> Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).</li><li>Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Ssa1/2p+is+the+cell+envelope+binding+protein+for+human+salivary+histatin+5.">Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).</li><li>Rothstein, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticandida+activity+is+retained+in+P-113,+a+12-amino-acid+fragment+of+histatin+5.">Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+Volume+transfers+with+serological+pipettes+and+micropipettors.">Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).</li><li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edge+effect:+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates.">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).</li><li>Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+growth+assay+for+determination+of+antifungal+susceptibility+of+Histoplasma+capsulatum+yeasts.">Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).</li></ol>

このプロトコルは、真菌病原体 C.アルビカンスに対するAMPの抗真菌活性に関する定量的データを取得するための効率的なアプローチを説明しています。ペプチドやその他の抗真菌剤を試験するための一般的な代替アプローチの1つは、臨床検査標準研究所(CLSI)の標準M2718に記載されているブロス微量希釈ですが、この標準は定量的結果ではなく定性的な視覚的結果を得?...

カンジダ・アルビカンスは、口腔、皮膚、胃腸管、膣など、多くの場所にコロニーを形成するヒト微生物叢のメンバーです1。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)や免疫抑制治療などの疾患のために免疫不全の患者の場合、C.アルビカンスのコロニー形成は局所的または全身性カンジダ症につながる可能性があります2,3。アムホテリシンB、アゾール、またはエキノカンジンなどの現在利用可能な低分子抗真菌治療薬の使用は、溶解性および毒性の問題、ならびに治療薬に対する感染の耐性によって複雑になる可能性があります4,5。現在の抗真菌剤の限界のために、研究者はC.アルビカンスに対して活性を有する新しい抗真菌分子を継続的に探索している。
抗菌ペプチド(AMP)は、現在の低分子抗真菌剤6,7,8の潜在的な代替物であり、低分子薬物9と比較して耐性の発生の影響を受けにくいことが提案されています。AMPは多様なペプチドのセットですが、多くの場合陽イオンであり、幅広い活性スペクトルを持っています10、11、12。C.アルビカンスに対する活性を有するAMPには、ヒスタチンおよびセクロピンファミリー13,14,15の周知のペプチド、ならびにToAP2、NDBP-5.7、およびヒスタチン5変異体K11R-K17R16,17などのより最近記載されたペプチドが含まれる。カンジダ感染症の治療に潜在的であるため、C.アルビカンスを標的とする新しいAMPの同定と設計は、多くの研究グループにとって重要な目標です。
C.アルビカンスを標的とする効果的なAMP(および他の抗真菌剤)を開発するプロセスの一環として、有望なペプチドを同定するためにin vitro試験が一般的に使用されます。C. albicansに対する抗真菌活性を試験する方法は、通常、96ウェルプレート中でAMPの段階希釈(バッファーまたは培地中)で細胞をインキュベートすることを含みます。インキュベーション後の抗真菌活性を評価するためにいくつかの方法が利用可能です。臨床検査標準研究所によって記述された技術は、ウェルの濁度の純粋に視覚的評価を使用して、成長の完全な阻害(アゾールやエキノカンジンなどの選択された抗真菌剤の少なくとも50%阻害)の最小濃度(MIC)を決定し、サブMIC濃度での成長の定量化を提供しません18.別の一般的に使用されるアプローチでは、寒天プレート上にウェルの内容物をプレーティングし、プレートをインキュベートし、プレート上のコロニー形成単位(CFU)の数をカウントすることにより、AMPとのインキュベーション後の生存率を定量化します。この方法は、ヒスタチン5ベースのペプチド、LL-37、およびヒトラクトフェリン19、20、21を含む多数のペプチドを評価するために使用されています。この技術は、比較的大量の寒天と多数のプレートを必要とし、プレート上のCFUの面倒なカウントを伴います。プラスチック廃棄物の発生を減らし、CFUのカウントを回避しながら、より定量的なデータを取得するには、ウェルの内容物を使用して、別の96ウェルプレートに新鮮な培地を接種することができます。新たに接種したプレートをインキュベートした後、成長は、吸光度プレートリーダー上で600nm(OD600)における光学密度を測定することによって定量化することができる。この方法は、ヒスタチン5およびその分解断片ならびに細胞透過性ペプチド17、22、23、24、25の抗真菌活性を決定するために使用されている。
このプロトコルは、ペプチドの抗真菌活性を試験する方法を説明し、OD600 法を使用して、ペプチドによる C.アルビカンスの 生存率の低下を定量化します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates (round bottom)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance microplate reader</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available microplate reader is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. albicans strain SC5314</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>MYA-2876</td>
			<td>Other C. albicans may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide(s)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of &#8805;95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs for multichannel pipettors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18900-320</td>
			<td>Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available UV spectrophotometer is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD medium powder</td>
			<td>BD Life Sciences</td>
			<td>242820</td>
			<td>May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the antifungal activity of peptides against candida albicans

カン ジダ・アルビカンスの 抗真菌感受性試験を実施する従来の方法は時間がかかり、定量的な結果が得られません。たとえば、一般的なアプローチは、寒天プレート上で異なる濃度の抗真菌分子で処理された細胞をプレーティングし、コロニーをカウントして分子濃度と増殖阻害の関係を決定することに依存しています。この方法では、コロニーを数えるのに多くのプレートとかなりの時間が必要です。別の一般的なアプローチは、抗真菌剤で処理された培養物を視覚的に検査して成長を阻害するのに必要な最小濃度を特定することにより、プレートとコロニーのカウントを排除します。しかし、目視検査では定性的な結果しか得られず、亜阻害濃度での増殖に関する情報は失われます。このプロトコルは、抗真菌ペプチドに対する C.アルビカンスの 感受性を測定するための方法を記載している。培養物の光学密度測定に依存することにより、この方法は、異なるペプチド濃度での培養増殖に関する定量結果を得るために必要な時間と材料を削減します。真菌とペプチドとのインキュベーションは、適切なバッファーを使用して96ウェルプレートで行われ、コントロールは成長阻害なしおよび完全な成長阻害を表します。ペプチドとのインキュベーションに続いて、得られた細胞懸濁液を希釈してペプチド活性を低下させ、次いで一晩増殖させる。一晩増殖後、各ウェルの光学濃度を測定し、ポジティブおよびネガティブコントロールと比較して、各ペプチド濃度で得られた増殖阻害を計算する。このアッセイを使用した結果は、培養物を寒天プレートにプレーティングする従来の方法を使用した結果に匹敵しますが、このプロトコルにより、プラスチック廃棄物とコロニーのカウントに費やす時間が削減されます。このプロトコルのアプリケーションは抗真菌ペプチドに焦点を当てていますが、この方法は、既知または疑われる抗真菌活性を持つ他の分子の試験にも適用できます。

OD600 測定を使用して抗真菌ペプチドによる増殖の減少を定量化することで、サンプルのメッキやCFUのカウントと比較して時間を大幅に節約できます。このプロトコルで説明されている方法では、3つの異なる日に手順を完了する必要があります。初日に、バッファーと培地(滅菌時間を含まない)を調製し、一晩インキュベーションするために C.アルビカンスの 出発培養物を接種?...

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Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

このプロトコルは、カン ジダ・アルビカンスに対するペプチドおよび他の化合物(例えば、小分子抗真菌剤)の抗真菌活性に関する定量的データを得るための方法を記載する。増殖阻害を定量化するためにコロニー形成単位をカウントするのではなく、光学密度を使用することで、時間とリソースを節約できます。

カンジダ・アルビカンスに対するペプチドの抗真菌活性の定量化

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a ...

ペプチドは、新規抗真菌分子として研究されています。このプロトコルは、ヒト真菌病原体カンジダアルビカンスに対する抗真菌効果を研究するために使用できます。この技術は、寒天上で作成する必要がある他の方法と比較して、実験時間とプラスチック廃棄物を削減しながら、抗真菌活性に関する定量的データを提供します。カンジダ・アルビカンスに対する活性を試験することに加えて、このプロトコルは、他の酵母形成細胞に対する活性を試験し、小分子抗真菌剤の活性を試験するために使用することができる培養チューブ内の10ミリリットルの液体酵母エキス−ペプトン−デキストロース、またはYPD培地に所望のカンジダ・アルビカンス株を接種することから始める。ロータリーシェーカーで摂氏30度、230rpmで一晩培養します。C.albicansの一晩培養物を継代培養し、600ナノメートルの波長で約1.0〜1.2の光学密度に増殖させる。各ペプチドを滅菌水に可溶化し、希望の最高濃度の2倍に希釈してから、40マイクロリットルの所望のペプチドストック溶液を丸底96ウェルプレートの各列の最初のウェルに加えます。次に、ペプチドを含む列の2〜12列に20マイクロリットルの滅菌超純水を加えます。プレート全体でカラム10までのペプチドストック溶液を連続希釈するには、カラム1からカラム2に20マイクロリットルを移し、上下にピペッティングして混合します。カラム1の濃度を1対512に希釈して40マイクロリットルのペプチド溶液を含むカラム10まで希釈プロセスを繰り返します。完了したら、カラム10から20マイクロリットルのペプチド溶液を取り出し、廃棄します。C.albicans継代培養物を15ミリリットルの遠沈管に移し、室温で3分間3, 900gで遠心分離する。ピペッティングまたはデカントによって上清を除去します。ペレットを1ミリリットルの2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁し、懸濁液を1.7ミリリットルの遠沈管に移します。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を廃棄する。再度、ペレットを1ミリリットルの2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、さらに2回洗浄して、洗浄した細胞を1ミリリットルのリン酸ナトリウム緩衝液中に放置する。洗浄した細胞懸濁液の細胞密度を決定し、懸濁液を2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液中で1ミリリットル当たり10〜5番目の細胞に5倍に希釈する。希釈したC.albicans細胞懸濁液を採取し、各行のカラム1〜10およびカラム12に20マイクロリットルを加え、次に20マイクロリットルの2ミリモルリン酸ナトリウムバッファーをカラム11に加えます。プレート1を覆い、摂氏30度のインキュベーターに30分間入れます。プレート番号2のすべてのウェルに100マイクロリットルのYPDを添加し、次にプレート2のすべてのウェルに100マイクロリットルの2ミリモルリン酸ナトリウムバッファーを加えて生存率を定量するために、新しい96ウェル培養プレートを準備します。プレート1でサンプルを希釈するには、インキュベーターからプレート1を取り出し、各ウェルに280マイクロリットルの1ミリモルリン酸ナトリウムバッファーを追加します。内容物ウェルをピペットで混合した後、プレート1からプレート2の対応するウェルに8マイクロリットルを移します。完了したら、カバー付きプレート2をマイクロタイタープレートシェーカーに350rpmで摂氏30度で17時間置きます。プレート2のすべてのウェルを上下にピペッティングして混合し、すべての細胞が再懸濁されていることを確認します。吸光度プレートリーダーを用いて、プレート2の各ウェルについて600ナノメートルの波長での光学濃度測定値を得る。増殖阻害パーセンテージを計算し、C.albicansの成長に対するペプチドの効果を決定するために、ペプチド濃度の関数として生存率の低下をプロットします。ペプチドをC.albicans細胞と共にインキュベートした後、抗真菌活性を、コロニー形成単位、またはCFU計数法および光学密度測定を組み込んだ記載のプロトコールを用いて定量化した。光学密度測定値を使用したデータは、反復の小さな標準偏差によって示されるように、再現性が高かった。このプロトコルを実行する際には、菌糸細胞では光学密度測定が信頼できないため、細胞を摂氏30度でインキュベートすることにより、カンジダ・アルビカンス細胞を酵母の形で維持します。この方法の効率により、研究者は、より多くのペプチドとペプチド濃度をテストすることにより、ペプチド活性に関する高いトリプル研究を実行することができました。

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

アミロイドペプチドに適用される変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

生物学

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

原虫シロアリ腸に対するリガンド - 溶解性ペプチドのProtozoacidal活性を試験する in vitroで（原生動物文化）と in vivoで（シロアリ後腸へのマイクロインジェクション）

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Gタンパク質共役受容体でアゴニスト活性を定量化

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...