Name: quantifying the antifungal activity of peptides against candida albicans
Uploaded: 2023-01-13T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03DE029270, T32AI089621B), la Fundación Nacional de Ciencias (CBET 1511718), el Departamento de Educación (GAANN-P200A180093) y una subvención semilla entre campus de la Universidad de Maryland.

Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Maryland, College Park, para el trabajo con C. albicans en este protocolo (PN 274). En el presente estudio se utilizó la cepa SC5314 de C. albicans (ver Tabla de Materiales); sin embargo, también se puede utilizar cualquier otra cepa.
1. Preparación del tampón, agua estéril y medio de cultivo
<ol><li>Preparar tampón estéril de fosfato sódic...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+Development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Arya, N. R., Rafiq, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis.">Candidiasis.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>de Oliveira Santos, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+infections+and+therapeutic+strategies:+Mechanisms+of+action+for+traditional+and+alternative+agents.">Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).</li><li>Espinel-Ingroff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+resistance+to+antifungal+agents:+Yeasts+and+filamentous+fungi.">Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi.</a> Revista Iberoamericana de Micolog&#237;a. 25 (2), 101-106 (2008).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+strategies+of+amphotericin+B+for+invasive+fungal+infections.">Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).</li><li>Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-interacting+antifungal+peptides.">Membrane-interacting antifungal peptides.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).</li><li>Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+Classification,+design,+application+and+research+progress+in+multiple+fields.">Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).</li><li>Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+proteins:+From+nature's+reservoir+to+the+laboratory+and+beyond.">Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).</li><li>Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+as+therapeutic+agents:+Opportunities+and+challenges.">Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).</li><li>Lei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptides+and+their+potential+clinical+applications.">The antimicrobial peptides and their potential clinical applications.</a> American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).</li><li>Mercer, D. K., O'Neil, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+inspiration:+Antifungal+peptides+and+other+immunotherapeutics+from+the+host+immune+response.">Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).</li><li>Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides:+An+update+on+classifications+and+databases.">Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).</li><li>Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticandidal+activity+of+major+human+salivary+histatins.">Anticandidal activity of major human salivary histatins.</a> Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).</li><li>Helmerhorst, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphotericin+B-+and+fluconazole-resistant+Candida+spp.,+Aspergillus+fumigatus,+and+other+newly+emerging+pathogenic+fungi+are+susceptible+to+basic+antifungal+peptides.">Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).</li><li>Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecropins,+antibacterial+peptides+from+insects+and+mammals,+are+potently+fungicidal+against+Candida+albicans.">Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).</li><li>do Nascimento Dias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+antimicrobial+peptides+ToAP2+and+NDBP-5.7+against+Candida+albicans+planktonic+and+biofilm+cells.">Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells.</a> Scientific Reports. 10, 10327 (2020).</li><li>Ikonomova, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histatin+5+modifications+on+antifungal+activity+and+kinetics+of+proteolysis.">Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis.</a> Protein Science. 29, 480-493 (2020).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , (2008).</li><li>Lupetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+activities+of+human+lactoferrin+peptides+derived+from+the+N+terminus.">Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).</li><li>Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+action+mechanism+of+histatin+5-halocidin+hybrid+peptides+against+Candida+ssp.">Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp.</a> PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).</li><li>den Hertog, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidacidal+effects+of+two+antimicrobial+peptides:+histatin+5+causes+small+membrane+defects,+but+LL-37+causes+massive+disruption+of+the+cell+membrane.">Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane.</a> Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).</li><li>Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+improved+variants+of+the+antifungal+peptide+histatin+5+with+reduced+susceptibility+to+Candida+albicans+secreted+aspartic+proteases+and+enhanced+antimicrobial+potency.">Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency.</a> The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).</li><li>Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5+variant+reduces+Candida+albicans+biofilm+viability+and+inhibits+biofilm+formation.">Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation.</a> Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).</li><li>Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+charge+and+hydrophobicity+in+translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+albicans+cells.">Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells.</a> AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).</li><li>Gong, Z., Karlsson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+cell-penetrating+peptides+into+Candida+fungal+pathogens.">Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens.</a> Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).</li><li>Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: <a target="_blank" href="https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf">https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf</a> (2022)</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antifungal+susceptibility+variables+for+a+semiautomated+methodology.">Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).</li><li>Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+and+mode+of+action+of+synthetic+peptides+derived+from+the+tick+OsDef2+defensin.">Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin.</a> Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).</li><li>Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis-mediated+vacuolar+accumulation+of+the+human+ApoE+apolipoprotein-derived+ApoEdpL-W+antimicrobial+peptide+contributes+to+its+antifungal+activity+in+Candida+albicans.">Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).</li><li>Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+of+the+hemolytic+and+fungicidal+activities+of+cationic+antimicrobial+peptides.">A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides.</a> FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).</li><li>Kerenga, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-tolerant+antifungal+and+antibacterial+activities+of+the+corn+defensin+ZmD32.">Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).</li><li>Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+and+salinity+on+the+antimicrobial+properties+of+clavanins.">Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins.</a> Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).</li><li>Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Ssa1/2p+is+the+cell+envelope+binding+protein+for+human+salivary+histatin+5.">Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).</li><li>Rothstein, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticandida+activity+is+retained+in+P-113,+a+12-amino-acid+fragment+of+histatin+5.">Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+Volume+transfers+with+serological+pipettes+and+micropipettors.">Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).</li><li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+edge+effect:+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates.">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).</li><li>Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+growth+assay+for+determination+of+antifungal+susceptibility+of+Histoplasma+capsulatum+yeasts.">Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).</li></ol>

Este protocolo describe un enfoque eficiente para obtener datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica de los AMP contra el patógeno fúngico C. albicans. Un enfoque alternativo común para probar péptidos y otros agentes antifúngicos es la microdilución en caldo descrita en el estándar M2718 del Instituto de Estándares de Laboratorio Clínico (CLSI), pero este estándar se centra en obtener resultados visuales cualitativos en lugar de resultados cuantitativos. Otro enfoque a...

Candida albicans es un miembro de la microbiota humana que coloniza numerosos lugares, incluyendo la cavidad oral, la piel, el tracto gastrointestinal y la vagina1. Para pacientes inmunocomprometidos debido a enfermedades como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y tratamientos inmunosupresores, la colonización de C. albicans puede conducir a candidiasis local o sistémica 2,3. El uso de terapias antifúngicas de moléculas pequeñas actualmente disponibles, como anfotericina B, azoles o equinocandinas, puede complicarse por problemas de solubilidad y toxicidad y por la resistencia de las infecciones a la terapéutica 4,5. Debido a las limitaciones de los agentes antifúngicos actuales, los investigadores están continuamente buscando nuevas moléculas antifúngicas con actividad contra C. albicans.
Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa potencial a los actuales agentes antifúngicos de moléculas pequeñas 6,7,8 y se propone que son menos susceptibles al desarrollo de resistencia en comparación con los fármacos de moléculas pequeñas 9. Los AMP son un conjunto diverso de péptidos, pero a menudo son catiónicos, con un amplio espectro de actividad10,11,12. Los AMP con actividad contra C. albicans incluyen péptidos bien conocidos de las familias histatina y cecropina 13,14,15, junto con péptidos descritos más recientemente como ToAP2, NDBP-5.7 y la variante de histatina 5 K11R-K17R16,17. Debido a su potencial para tratar las infecciones por Candida, identificar y diseñar nuevos AMP que se dirijan a C. albicans es un objetivo importante para muchos grupos de investigación.
Como parte del proceso para desarrollar AMP efectivos (y otros agentes antifúngicos) que se dirigen a C. albicans, las pruebas in vitro se usan comúnmente para identificar péptidos prometedores. Los métodos para probar la actividad antifúngica contra C. albicans generalmente implican incubar células con diluciones seriadas de los AMP (en tampón o medio) en placas de 96 pocillos. Hay varios métodos disponibles para evaluar la actividad antifúngica después de la incubación. Una técnica descrita por el Clinical Laboratory Standards Institute utiliza una evaluación puramente visual de la turbidez de los pocillos para determinar la concentración mínima (CMI) para la inhibición completa del crecimiento (al menos 50% de inhibición para agentes antifúngicos seleccionados, como azoles y equinocandinas) y no proporciona cuantificación del crecimiento a concentraciones sub-CMI18 . Otro enfoque comúnmente utilizado consiste en cuantificar la viabilidad después de la incubación con AMP mediante el recubrimiento del contenido de los pocillos en placas de agar, la incubación de las placas y luego el recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) en la placa. Este método se ha utilizado para evaluar una serie de péptidos, incluidos los péptidos basados en histatina 5, LL-37 y la lactoferrina humana 19,20,21. Esta técnica requiere un volumen relativamente grande de agar y un alto número de placas e implica el tedioso conteo de UFC en las placas. Para obtener más datos cuantitativos y generar menos residuos plásticos y evitar el conteo de UFC, el contenido de los pocillos se puede utilizar para inocular medio fresco en otra placa de 96 pocillos. Después de incubar la placa recién inoculada, el crecimiento se puede cuantificar midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un lector de placas de absorbancia. Este método ha sido utilizado para determinar la actividad antifúngica de la histatina 5 y sus fragmentos de degradación y péptidos penetrantes celulares 17,22,23,24,25.
Este protocolo describe cómo probar la actividad antifúngica de péptidos y utiliza el método OD600 para cuantificar la reducción de la viabilidad de C. albicans debido a péptidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates (round bottom)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance microplate reader</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available microplate reader is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. albicans strain SC5314</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>MYA-2876</td>
			<td>Other C. albicans may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide(s)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of &#8805;95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs for multichannel pipettors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18900-320</td>
			<td>Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>For making NaPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any available UV spectrophotometer is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD medium powder</td>
			<td>BD Life Sciences</td>
			<td>242820</td>
			<td>May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the antifungal activity of peptides against candida albicans

Los métodos tradicionales para realizar pruebas de susceptibilidad antifúngica para Candida albicans consumen mucho tiempo y carecen de resultados cuantitativos. Por ejemplo, un enfoque común se basa en placas de células tratadas con diferentes concentraciones de moléculas antifúngicas en placas de agar y luego contar las colonias para determinar la relación entre la concentración de moléculas y la inhibición del crecimiento. Este método requiere muchas placas y un tiempo sustancial para contar las colonias. Otro enfoque común elimina las placas y el conteo de colonias mediante la inspección visual de cultivos tratados con agentes antifúngicos para identificar la concentración mínima requerida para inhibir el crecimiento; sin embargo, la inspección visual produce sólo resultados cualitativos, y se pierde información sobre el crecimiento a concentraciones subinhibitorias. Este protocolo describe un método para medir la susceptibilidad de C. albicans a péptidos antifúngicos. Al basarse en mediciones de densidad óptica de cultivos, el método reduce el tiempo y los materiales necesarios para obtener resultados cuantitativos sobre el crecimiento del cultivo a diferentes concentraciones de péptidos. La incubación del hongo con péptidos se realiza en una placa de 96 pocillos utilizando un tampón apropiado, con controles que representan ninguna inhibición del crecimiento e inhibición completa del crecimiento. Después de la incubación con el péptido, las suspensiones celulares resultantes se diluyen para reducir la actividad peptídica y luego se cultivan durante la noche. Después del crecimiento nocturno, se mide la densidad óptica de cada pocillo y se compara con los controles positivos y negativos para calcular la inhibición del crecimiento resultante en cada concentración de péptidos. Los resultados utilizando este ensayo son comparables a los resultados utilizando el método tradicional de chapado de los cultivos en placas de agar, pero este protocolo reduce los residuos plásticos y el tiempo dedicado a contar colonias. Aunque las aplicaciones de este protocolo se han centrado en péptidos antifúngicos, el método también será aplicable para probar otras moléculas con actividad antifúngica conocida o sospechada.

El uso de mediciones de OD600 para cuantificar la reducción en el crecimiento debido a péptidos antifúngicos ahorra un tiempo sustancial en comparación con el recubrimiento de muestras y el recuento de UFC. El método descrito en este protocolo requiere completar los pasos en tres días diferentes. El primer día, se necesita aproximadamente 1 h para preparar los tampones y medios (sin incluir el tiempo de esterilización) e inocular el cultivo inicial de C. albicans para la incubación nocturna. ...

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Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

Este protocolo describe un método para obtener datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica de péptidos y otros compuestos, como agentes antifúngicos de moléculas pequeñas, contra Candida albicans. Su uso de la densidad óptica en lugar de contar las unidades formadoras de colonias para cuantificar la inhibición del crecimiento ahorra tiempo y recursos.

Cuantificación de la actividad antifúngica de péptidos contra Candida albicans

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a ...

Los péptidos se están estudiando como nuevas moléculas antifúngicas. Este protocolo se puede utilizar para estudiar la eficacia antifúngica contra el patógeno fúngico humano Candida albicans. Esta técnica proporciona datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica al tiempo que reduce el tiempo experimental y los desechos plásticos en comparación con los otros métodos que requieren la creación en agar.Además de probar la actividad contra Candida albicans, este protocolo se puede utilizar para probar la actividad contra otras células formadoras de levadura y para probar la actividad de agentes antifúngicos de moléculas pequeñas Comience por inocular la cepa deseada de Candida albicans en 10 mililitros de extracto de levadura líquida-peptona-dextrosa, o medio YPD, en un tubo de cultivo. Cultive el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados y 230 rpm en un agitador rotativo. Subcultivo El cultivo nocturno de C.albicans y crecer a una densidad óptica de aproximadamente 1.0 a 1.2 a 600 nanómetros de longitud de onda.Solubilice cada péptido en agua estéril y dilúyalo al doble de la concentración más alta deseada, luego agregue 40 microlitros de las soluciones madre de péptidos deseadas al primer pocillo de cada fila en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, agregue 20 microlitros de agua ultrapura estéril a las columnas 2 a 12 de las filas que contienen el péptido. Para diluir en serie las soluciones madre de péptidos a través de la placa hasta la columna 10, transfiera 20 microlitros de la columna 1 a la columna 2 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Repita el proceso de dilución hasta la columna 10, que contendrá 40 microlitros de solución peptídica en una dilución de 1 a 512 de la concentración de la columna 1. Una vez hecho esto, retire 20 microlitros de solución peptídica de la columna 10 y deséchela. Transfiera el subcultivo de C.albicans a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugar a 3, 900 g durante 3 minutos a temperatura ambiente.Retirar el sobrenadante mediante pipeteo o decantación. Vuelva a suspender el pellet con 1 mililitro de tampón de fosfato de sodio de 2 milimolares y transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros. Granular las células centrifugando y desechar el sobrenadante.Nuevamente, resuspenda el pellet en 1 mililitro de tampón fosfato de sodio 2-milimolar y lave 2 veces más para dejar las celdas lavadas en 1 mililitro de tampón fosfato de sodio. Determine la densidad celular de la suspensión de células lavadas y diluya la suspensión de 5 veces 10 a la quinta celda por mililitro en un tampón de fosfato de sodio de 2 milimolares. Tome la suspensión celular C.albicans diluida y agregue 20 microlitros a las columnas 1 a 10 y a la columna 12 de cada fila, luego agregue 20 microlitros de tampón de fosfato de sodio 2 milimolar a la columna 11.Cubra la placa 1 y colóquela en una incubadora a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Prepare una nueva placa de cultivo de 96 pocillos para cuantificar la viabilidad agregando 100 microlitros de YPD a todos los pocillos de la placa número 2, luego agregue 100 microlitros de tampón de fosfato de sodio 2-milimolar a todos los pocillos de la placa 2. Para diluir las muestras en la placa 1, recupere la placa 1 de la incubadora y agregue 280 microlitros de tampón de fosfato de sodio 1 milimolar en cada pozo.Después de mezclar bien el contenido con una pipeta, transfiera 8 microlitros de la placa 1 al pocillo correspondiente de la placa 2. Una vez hecho esto, coloque la placa cubierta 2 en un agitador de placas de microtitulación a 350 rpm durante 17 horas a 30 grados centígrados. Mezcle todos los pocillos en la placa 2 pipeteando hacia arriba y hacia abajo, asegurando que todas las celdas estén resuspendidas.Obtenga lecturas de densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros para cada pocillo en la placa 2 utilizando un lector de placas de absorbancia. Trazar la reducción de la viabilidad en función de la concentración de péptidos para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento y determinar el efecto de los péptidos sobre el crecimiento de C.albicans. Después de incubar los péptidos con las células de C.albicans, la actividad antifúngica se cuantificó utilizando las unidades formadoras de colonias, o método de conteo de UFC y el protocolo descrito incorporando mediciones de densidad óptica.Los datos que utilizaron las lecturas de densidad óptica fueron altamente reproducibles, como lo indican las pequeñas desviaciones estándar de las réplicas. Al realizar este protocolo, mantenga las células de Candida albicans en forma de levadura incubando las células a 30 grados centígrados, ya que las mediciones de densidad óptica no son confiables en las células hifales. La eficiencia de este método ha permitido a los investigadores realizar estudios triples sobre la actividad peptídica mediante la prueba de un mayor número de péptidos y concentraciones de péptidos.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

Investigación

Biología

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Medición de actividad enzimática de la lactasa en el laboratorio de enseñanza

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...