Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

نشكر جيمس باردويل وتياغو ف. أوتيرو على تفضلهما بمشاركة البلازميدات التي تحتوي على α-synuclein. تلقى Changhan Lee تمويلا من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (MSIT) (منحة 2021R1C1C1011690) ، وبرنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال NRF الممول من وزارة التعليم (منحة 2021R1A6A1A10044950) ، وصندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس الجديد بجامعة Ajou.

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول
<ol><li>التحضير لوسائط الإعلام<ol><li>لتحضير وسط YPD ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD في dH2O لعمل حجم نهائي قدره 1 لتر. الأوتوكلاف للتعقيم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
		<li>لجعل أجار YPD متوسطا ، قم بإذابة 50 جم من مسحوق YPD و 20 جم من أجار في 1 لتر من dH2O. الأو...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

نظرا لتعقيد الأنظمة الخلوية المختلفة في البشر ، من المفيد استخدام الخميرة كنموذج لدراسة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. على الرغم من أنه يكاد يكون من المستحيل التحقيق في التفاعلات الخلوية المعقدة للدماغ البشري باستخدام الخميرة ، من منظور خلية واحدة ، فإن خلايا الخميرة لديها مستوى عال ...

مرض باركنسون (PD) هو مشكلة خطيرة للمجتمعات الشيخوخة في جميع أنحاء العالم. يرتبط تجميع α-synuclein ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون ، وتستخدم مجاميع البروتين من α-synuclein على نطاق واسع كعلامة حيوية جزيئية لتشخيص المرض1. α-synuclein هو بروتين حمضي صغير (140 من الأحماض الأمينية في الطول) مع ثلاثة مجالات ، وهي N-terminal ربط الدهون α-helix ، والمجال المركزي المرتبط بالأميلويد (NAC) ، والذيل الحمضيC-terminal 2. يمكن أن يحدث اختلال α-synuclein تلقائيا ويؤدي في النهاية إلى تكوين مجاميع أميلويد تسمى أجسام ليوي3. قد يساهم α-synuclein في التسبب في مرض باركنسون بعدة طرق. بشكل عام ، يعتقد أن أشكالها قليلة القسيمات غير الطبيعية القابلة للذوبان والتي تسمى protofibrils هي أنواع سامة تسبب موت الخلايا العصبية من خلال التأثير على أهداف خلوية مختلفة ، بما في ذلك الوظيفة المشبكية3.
يجب أن تكون النماذج البيولوجية المستخدمة لدراسة الأمراض التنكسية العصبية ذات صلة بالبشر فيما يتعلق بالجينوم والبيولوجيا الخلوية. أفضل النماذج هي خطوط الخلايا العصبية البشرية. ومع ذلك ، ترتبط خطوط الخلايا هذه بالعديد من المشكلات الفنية ، مثل الصعوبات في الحفاظ على الثقافات ، وانخفاض كفاءة النقل ، وارتفاع النفقات4. لهذه الأسباب ، هناك حاجة إلى أداة سهلة وموثوقة لتسريع التقدم في هذا المجال البحثي. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الأداة سهلة الاستخدام لتحليل البيانات التي تم جمعها. من هذه المنظورات ، تم استخدام كائنات نموذجية مختلفة على نطاق واسع ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ، و Caenorhabditis elegans ، و Danio rerio ، والخميرة ، والقوارض5. من بينها ، الخميرة هي أفضل كائن نموذجي لأن التلاعب الجيني سهل ، وهو أرخص من الكائنات الحية النموذجية الأخرى. الأهم من ذلك ، أن الخميرة لها أوجه تشابه عالية مع الخلايا البشرية ، مثل 60٪ تماثل تسلسلي مع تقويم العظام البشري و 25٪ تماثل وثيق مع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية6 ، كما أنها تشترك في بيولوجيا الخلية حقيقية النواة الأساسية. تحتوي الخميرة على العديد من البروتينات ذات التسلسلات المتشابهة والوظائف المماثلة لتلك الموجودة في الخلايا البشرية7. في الواقع ، تم استخدام الخميرة التي تعبر عن الجينات البشرية على نطاق واسع كنظام نموذجي لتوضيح العمليات الخلوية8. تسمى سلالة الخميرة هذه الخميرة المؤنسنة وهي أداة مفيدة لاستكشاف وظيفة الجينات البشرية9. الخميرة المتوافقة مع البشر لها ميزة لدراسة التفاعلات الجينية لأن التلاعب الجيني راسخ في الخميرة.
في هذه الدراسة ، استخدمنا الخميرة Saccharomyces cerevisiae ككائن نموذجي لدراسة التسبب في مرض باركنسون ، خاصة للتحقيق في تكوين إجمالي α-synuclein والسمية الخلوية10. للتعبير عن α-synuclein في الخميرة الناشئة ، تم استخدام سلالة W303a للتحول مع ترميز البلازميدات للمتغيرات البرية والعائلية المرتبطة ب PD من α-synuclein. نظرا لأن سلالة W303a لها طفرة ذاتية التغذية على URA3 ، فهي قابلة للتطبيق لاختيار الخلايا التي تحتوي على البلازميدات مع URA3. يتم تنظيم التعبير عن α-synuclein المشفر في البلازميد تحت مروج GAL1. وبالتالي ، يمكن التحكم في مستوى التعبير عن α-synuclein. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في المنطقة الطرفية C من α-synuclein يسمح بمراقبة تكوين بؤر α-synuclein. لفهم خصائص المتغيرات العائلية المرتبطة ب PD ل α-synuclein ، قمنا أيضا بالتعبير عن هذه المتغيرات في الخميرة وفحصنا آثارها الخلوية. هذا النظام هو أداة مباشرة لفحص المركبات أو الجينات التي تظهر أدوارا وقائية ضد السمية الخلوية ل α-synuclein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

مرض باركنسون هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية شيوعا ويتميز بموت الخلايا التدريجي الناجم عن تكوين أجسام ليوي التي تحتوي على α سينوكلين غير مطوية ومجمعة. α-synuclein هو بروتين وفير قبل المشبكي ينظم الاتجار بالحويصلة المشبكية ، لكن تراكم شوائب البروتين يؤدي إلى سمية عصبية. كشفت الدراسات الحديثة أن العوامل الوراثية المختلفة ، بما في ذلك المرافقين البكتيريين ، يمكن أن تقلل من تكوين مجاميع α-synuclein في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أيضا مراقبة التأثير المضاد للتجميع في الخلية لتطبيق هذا كعلاج محتمل للمرضى. سيكون من المثالي استخدام الخلايا العصبية ، ولكن يصعب التعامل مع هذه الخلايا وتستغرق وقتا طويلا لإظهار النمط الظاهري المضاد للتجميع. لذلك ، يلزم وجود أداة سريعة وفعالة في الجسم الحي لإجراء مزيد من التقييم لنشاط مكافحة التجميع في الجسم الحي. تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لمراقبة وتحليل النمط الظاهري المضاد للتجميع في الخميرة البشرية Saccharomyces cerevisiae ، والتي عبرت عن α synuclein البشري. يوضح هذا البروتوكول في الجسم الحي الأدوات التي يمكن استخدامها لرصد السمية الخلوية التي يسببها α سينوكلين ، وكذلك تكوين مجاميع α سينوكلين في الخلايا.

من المعروف أن التعبير العالي ل α-synuclein مرتبط بموت الخلايا العصبية و PD في الأنظمة النموذجية ل PD. تصف هذه الدراسة ثلاث طرق لمراقبة السمية الخلوية ل α-synuclein وتشكيل بؤر α-synuclein المجمعة في الخميرة. هنا ، تم التعبير عن α-synuclein بشكل مفرط في الخميرة ، وتم فحص الأنماط الظاهرية للنوع البري α-synuclein وثلاثة...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

هذه طريقة مباشرة لمراقبة الأنماط الظاهرية الخلوية وخصائص نوى R-pass. يمكن أيضا استعادته في كثير من الأحيان في دراسة على مستوى الجينوم للعثور على العوامل الوراثية التي تؤثر على استقرار نوى R-pass. نظرا لأن هذا كائن حركي راسخ ، فإن هذه التقنية سهلة ولا تتطلب الكثير من الوقت والجهد مقارنة باستخدام خطوط الخلايا البشرية أو النماذج الحيوانية.يرتبط تجميع نوى R-pass ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون. يمكن اختبار البروتينات أو المواد الكيميائية التي من المحتمل أن تؤثر على استقرار نوى R-pass في نموذج الخميرة المتوافق مع البشر. للبدء ، قم بتصحيح ثلاث مستعمرات مفردة على لوحة أجار SD-URA لاختيار الخلايا التي تحتوي على بلازميدات ألفا سينوكلين.بعد ذلك ، قم بتلقيح محولات الخميرة ثلاثية البقع لكل سلالة إلى 3 ملليلتر من SRD-URA للنمو الانتقائي للخميرة التي تحتوي على البلازميدات مع 2٪ رافينوز لتثبيط تحريض ألفا سينوكلين تحت محفز Gal1 و 0.1٪ جلوكوز. احتضان الثقافة الملقحة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل إلى 3 ملليلتر من SRD-URA الطازج حتى تصل إلى كثافة بصرية تبلغ 0.2 عند 600 نانومتر.بعد ذلك ، احتضان الثقافة لمدة ست ساعات عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بتخفيف العينات إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 600 نانومتر بالماء المقطر المعقم في الحارة 1 من لوحة 96 بئرا لمعادلة عدد الخلايا في كل مزرعة.قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 5 أضعاف لخلايا الخميرة عن طريق إضافة 160 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى الممرات الخمسة التالية وتأكد من حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر عند تخفيف الخلايا بشكل متسلسل في كل حارة. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولتر من كل بئر لاكتشاف العينات على ألواح أجار SD-URA للعناصر التحكم وألواح أجار SG-URA لمراقبة السمية. احتضان الصفائح المرقطة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام.التقط صورا للصفائح كل 24 ساعة حتى اليوم الرابع ثم حلل البيانات من خلال مقارنة اختلافات النمو بين السلالات التي رصدتها العين. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة الثلاثة لكل سلالة إلى ثلاثة ملليلتر من SRD-URA واحتضانها عند 30 درجة مئوية تحت الإثارة بمعدل 200 دورة في الدقيقة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة البصرية للخلايا المزروعة طوال الليل عند 600 نانومتر وتلقيح الخلايا إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر من SD-URA و SG-URA الطازجة في 96 لوحة بئر.اضبط الحجم النهائي بما في ذلك الخلايا على 200 ميكرولتر واضبط الكثافة البصرية الأولية للخلية على 0.05 عند 600 نانومتر. اضبط إعدادات البرنامج في لوحة المعايرة الدقيقة. اضبط درجة الحرارة المستهدفة على 30 درجة مئوية ، ووقت الفاصل الزمني على 15 دقيقة ، ومدة الاهتزاز على 890 ثانية ، وسعة الاهتزاز على 5 ملم ، والقياس على أنه امتصاص عند 600 نانومتر.احتضان اللوحة لمدة 2-3 أيام لجميع السلالات للوصول إلى المرحلة الثابتة في قارئ الصفيحة الدقيقة. تحليل البيانات عن طريق رسم منحنى النمو. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة إلى 3 ملليلتر من SRD-URA واستزرعها طوال الليل عند 30 درجة مئوية تحت التحريك بمعدل 200 دورة في الدقيقة.في اليوم التالي ، أعد تلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل إلى 3 ملليلتر من SRD-URA الطازج إلى كثافة بصرية تبلغ 0.003 عند 600 نانومتر ، ثم احتضان الثقافة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى تصل الكثافة البصرية إلى 0.2. ثم أضف 300 ميكرولتر من 20٪ من الجالاكتوز ، ثم احتضن لمدة 6 ساعات أخرى عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. جمع ملليلتر واحد من ثقافة الخلية عن طريق الطرد المركزي في 800 غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف .أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 30 ميكرولتر من الماء المقطر. تحضير وسادة هلام agarose على شريحة زجاجية. أعد تعليق الخلايا وقم بتحميل خمسة ميكرولترات من إعادة تعليق الخلية على الشريحة الزجاجية ، وقم بتغطية الخلايا باستخدام وسادة الأغاروز المقطوعة للفحص.لإجراء التصوير المجهري بهدف 100x ، استخدم خيار التقاط الشاشة لتوليد الصور باستخدام البرنامج وحدد brightfield لتركيز الخلية بهدف 100x باستخدام زيت الغمر. قم بالتبديل إلى مرشح مضان GFP واضبط وقت تعريض الصورة إلى ما بين 50 مللي ثانية و 300 مللي ثانية للحصول على صورة واضحة من خلال موازنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. افتح ملف الصورة وقم بتحليل البيانات عن طريق حساب الخلايا بناء على عدد البؤر في الخلايا باستخدام برنامج تحليل الصور.أظهر تعبير السينوكلين تحت محفز Gal1 في ناقل PRS426 تأخرا كبيرا في النمو على صفيحة الأجار التي تحتوي على الجالاكتوز كمحفز. كما لوحظ الفرق في النمو عن طريق تعبير synuclein في الثقافات السائلة. في كلتا الحالتين ، أظهر السينوكلين من النوع البري والمتغيرات ذات طفرات E46K أو A53T عيوبا في النمو بسبب سمية السينوكلين.ومع ذلك ، أظهر متغير synuclein A30p ، الذي لا يشكل مجاميع ، نمطا ظاهريا غير سام. أظهرت السلالات التي تظهر سمية خلوية شديدة بؤر مجاميع سينوكلين ، ولكن في متغير A30p ، تم نشر شكل أقل سمية من synuclein في جميع أنحاء الخلايا. لتحقيق نتائج قابلة للتكرار ، من المهم استخدام الخلية في نفس مرحلة النمو في كل تجربة ، خاصة عند مراقبة الأنماط الظاهرية المرتبطة بالسينوكلين.كما أوضحنا في بيانات المجهر الفلوري ، يمكن أن يشكل synuclein مجاميع أكبر. لذلك ، يمكن تجزئته ببساطة عن طريق الطرد المركزي ويمكن قياسه كميا عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالسينوكلين. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الفحص عالي الإنتاجية للعثور على عوامل وراثية جديدة ومركبات كيميائية تؤثر على تجميع سينوكلين.وبالتالي ، نأمل في العثور على مرشحين علاجيين جدد لمرض باركنسون.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

باستخدام كامل-- جبل المناعية طريقة لدراسة التعصيب من القناة الصفراوية في<em&gt; سونكوس مورينوس</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...