Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

Vi takker James Bardwell og Tiago F. Outeiro for venligt at dele plasmiderne indeholdende α-synuclein. Changhan Lee modtog finansiering fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIT) (tilskud 2021R1C1C1011690), Basic Science Research Program gennem NRF finansieret af Undervisningsministeriet (tilskud 2021R1A6A1A10044950) og den nye fakultetsforskningsfond ved Ajou University.

1. Fremstilling af medier og opløsninger
<ol><li>Forberedelse af medierne<ol><li>For at fremstille YPD-medium opløses 50 g YPD-pulver idH2O-væsketil et slutvolumen på 1 L. Autoklave til sterilisering. Opbevares ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>For at fremstille YPD-agarmedium opløses 50 g YPD-pulver og 20 g agar i 1 literdH2O. Autoklave til sterilisering. Efter afkøling hældes på petriskåle. Opbevares ved 4 °C.</li>
		<li>For at fremstille SC med raffinose (SRd)-Ura-m...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

I betragtning af kompleksiteten af forskellige cellulære systemer hos mennesker er det fordelagtigt at anvende gær som model til undersøgelse af humane neurodegenerative sygdomme. Selvom det er næsten umuligt at undersøge de komplekse cellulære interaktioner i den menneskelige hjerne ved hjælp af gær, har gærceller fra et enkeltcelleperspektiv et højt niveau af lighed med humane celler med hensyn til genomisk sekvenshomologi og grundlæggende eukaryote cellulære processer 8,13</sup...

Parkinsons sygdom (PD) er et alvorligt problem for aldrende samfund over hele verden. Aggregeringen af α-synuclein er tæt forbundet med PD, og proteinaggregater af α-synuclein anvendes i vid udstrækning som en molekylær biomarkør til diagnosticering af sygdommen1. α-synuclein er et lille surt protein (140 aminosyrer i længden) med tre domæner, nemlig det N-terminale lipidbindende α-helix, det amyloidbindende centrale domæne (NAC) og den C-terminale sure hale2. Fejlfoldningen af α-synuclein kan forekomme spontant og fører til sidst til dannelsen af amyloidaggregater kaldet Lewy-legemer3. α-synuclein kan bidrage til patogenesen af PD på flere måder. Generelt menes det, at dets unormale, opløselige oligomere former kaldet protofibriller er giftige arter, der forårsager neuronal celledød ved at påvirke forskellige cellulære mål, herunder synaptisk funktion3.
De biologiske modeller, der anvendes til at studere neurodegenerative sygdomme, skal være relevante for mennesker med hensyn til deres genom og cellulære biologi. De bedste modeller ville være menneskelige neuronale cellelinjer. Disse cellelinjer er imidlertid forbundet med flere tekniske problemer, såsom vanskeligheder med vedligeholdelse af kulturer, lav effektivitet af transfektion og høje omkostninger4. Derfor er der behov for et let og pålideligt værktøj til at fremskynde fremskridtene på dette forskningsområde. Det er vigtigt, at værktøjet skal være let at bruge til analyse af de indsamlede data. Fra disse perspektiver er forskellige modelorganismer blevet anvendt i vid udstrækning, herunder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gær og gnavere5. Blandt dem er gær den bedste modelorganisme, fordi genetisk manipulation er let, og det er billigere end de andre modelorganismer. Vigtigst er det, at gær har store ligheder med humane celler, såsom 60% sekvenshomologi til humane ortologer og 25% tæt homologi med humane sygdomsrelaterede gener6, og de deler også grundlæggende eukaryot cellebiologi. Gær indeholder mange proteiner med lignende sekvenser og analoge funktioner som dem i humane celler7. Faktisk er gær, der udtrykker menneskelige gener, blevet brugt i vid udstrækning som et modelsystem til at belyse cellulære processer8. Denne gærstamme kaldes humaniseret gær og er et nyttigt værktøj til at udforske funktionen af menneskelige gener9. Humaniseret gær har fortjeneste for at studere genetiske interaktioner, fordi genetisk manipulation er veletableret i gær.
I denne undersøgelse brugte vi gæren Saccharomyces cerevisiae som modelorganisme til at studere patogenesen af PD, især til undersøgelse af dannelse af α-synuclein aggregat og cytotoksicitet10. Til ekspression af α-synuclein i den spirende gær blev W303a-stammen anvendt til transformation med plasmider, der koder for de vildtype- og familiære PD-associerede varianter af α-synuclein. Da W303a-stammen har en auxotrofisk mutation på URA3, er den anvendelig til udvælgelse af celler indeholdende plasmider med URA3. Ekspressionen af α-synuclein kodet i et plasmid reguleres under GAL1-promotoren. Således kan ekspressionsniveauet for α-synuclein styres. Derudover tillader fusionen af grønt fluorescerende protein (GFP) i den C-terminale region af α-synuclein overvågning af dannelsen af α-synucleinfoci. For at forstå egenskaberne ved de familiære PD-associerede varianter af α-synuclein udtrykte vi også disse varianter i gær og undersøgte deres cellulære virkninger. Dette system er et ligetil værktøj til screening af forbindelser eller gener, der udviser beskyttende roller mod cytotoksiciteten af α-synuclein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

Parkinsons sygdom er den næstmest almindelige neurodegenerative lidelse og er karakteriseret ved progressiv celledød forårsaget af dannelsen af Lewy-kroppe, der indeholder forkert foldede og aggregerede α-synuclein. α-synuclein er et rigeligt præsynaptisk protein, der regulerer synaptisk vesikelhandel, men akkumuleringen af dets proteinholdige indeslutninger resulterer i neurotoksicitet. Nylige undersøgelser har vist, at forskellige genetiske faktorer, herunder bakterielle chaperoner, kan reducere dannelsen af α-synucleinaggregater in vitro. Det er dog også vigtigt at overvåge antiaggregeringseffekten i cellen for at anvende dette som en potentiel behandling for patienterne. Det ville være ideelt at bruge neuronale celler, men disse celler er vanskelige at håndtere og tager lang tid at udvise anti-aggregeringsfænotypen. Der er derfor behov for et hurtigt og effektivt in vivo-værktøj til yderligere evaluering af in vivo-antiaggregeringsaktivitet. Metoden beskrevet her blev brugt til at overvåge og analysere anti-aggregeringsfænotypen i den humaniserede gær Saccharomyces cerevisiae, som udtrykte humant α-synuclein. Denne protokol demonstrerer in vivo-værktøjer, der kan bruges til overvågning af α-synuclein-induceret cellulær toksicitet samt dannelsen af α-synucleinaggregater i celler.

Den høje ekspression af α-synuclein er kendt for at være forbundet med neuronal celledød og PD i modelsystemer af PD. Denne undersøgelse beskriver tre metoder til overvågning af cytotoksiciteten af α-synuclein og focidannelsen af aggregeret α-synuclein i gær. Her blev α-synuclein overudtrykt i gær, og fænotyperne af vildtype α-synuclein og tre varianter af α-synuclein kendt som familiære mutanter af PD blev undersøgt (figur 1 og materialetabellen).
<p cla...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

En in vivo fysiologisk model af α-synuclein er nødvendig for at studere og forstå patogenesen af Parkinsons sygdom. Vi beskriver en metode til overvågning af cytotoksicitet og samlet dannelse af α-synuclein ved hjælp af en humaniseret gærmodel.

En metode til undersøgelse af α-synuclein toksicitet og aggregering ved hjælp af en humaniseret gærmodel

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Dette er en ligetil metode til at overvåge cellulære fænotyper og funktioner i R-pass kerner. Det kan også ofte genvindes i genom-dækkende undersøgelse for at finde de genetiske faktorer, der påvirker stabiliteten af R-pass kerner. Da dette er en veletableret motorisk organisme, er denne teknik let og kræver ikke meget tid og kræfter sammenlignet med at bruge humane cellelinjer eller dyremodeller.Aggregeringen af R-pass kerner er tæt forbundet med Parkinsons sygdom. De proteiner eller kemikalier, der sandsynligvis påvirker stabiliteten af R-pass kerner, kan testes i denne humaniserede gærmodel. Til at begynde med skal du lappe tre enkeltkolonier på en SD-URA-agarplade til udvælgelse af celler indeholdende alfa-synucleinplasmider.Derefter inokuleres de trelappede gærtransformanter pr. stamme i 3 ml SRD-URA til selektiv vækst af gær indeholdende plasmiderne med 2% raffinose til hæmning af induktionen af alfa-synuclein under Gal1-promotoren og 0,1% glucose. Den podede kultur inkuberes ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut. Den næste dag inokuleres de dyrkede celler natten over i 3 ml frisk SRD-URA, indtil de når en optisk tæthed på 0,2 ved 600 nanometer.Derefter inkuberes kulturen i seks timer ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut. Mål den optiske densitet ved 600 nanometer ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd derefter prøverne til en optisk densitet på 0,5 ved 600 nanometer med sterilt destilleret vand i bane 1 på en 96-brøndplade for at udligne antallet af celler i hver kultur.Udfør 5 gange serielle fortyndinger af gærcellerne ved at tilsætte 160 mikroliter sterilt destilleret vand til de næste fem baner og sikre et samlet volumen på 40 mikroliter, når cellerne serielt fortyndes i hver bane. Brug en multikanalpipette til at overføre 10 mikroliter fra hvert hul for at få øje på prøverne på SD-URA-agarplader til kontrollerne og SG-URA-agarplader til overvågning af toksicitet. Inkuber de plettede plader på hovedet ved 30 grader celsius i fire dage.Tag billeder af pladerne hver 24. time indtil dag fire, og analyser derefter dataene ved at sammenligne vækstforskellene mellem stammer, der er spottet af øjet. Pod de tre patchede gærtransformanter pr. stamme i tre ml SRD-URA og inkuber ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut natten over. Den næste dag måles den optiske tæthed af cellerne dyrket natten over ved 600 nanometer og inokuleres cellerne i alt 200 mikroliter frisk SD-URA og SG-URA i 96-brøndplader.Juster det endelige volumen inklusive cellerne til 200 mikroliter, og juster den oprindelige celleoptiske tæthed til 0,05 ved 600 nanometer. Juster programindstillingerne i mikrotiterpladen. Indstil måltemperaturen til 30 grader celsius, intervaltiden til 15 minutter, rystetiden til 890 sekunder, rysteamplituden til 5 mm og målingen som absorbans til 600 nanometer.Inkuber pladen i 2-3 dage, så alle stammerne når den stationære fase i en mikropladelæser. Analysér dataene ved at plotte vækstkurven. Pod de lappede gærtransformanter i 3 ml SRD-URA og dyrk dem natten over ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut.Den næste dag inokuleres de dyrkede celler natten over i 3 ml frisk SRD-URA til en optisk densitet på 0,003 ved 600 nanometer, og inkuber derefter kulturen ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut, indtil den optiske densitet når 0,2. Derefter tilsættes 300 mikroliter 20% galactose, og inkuberes derefter i yderligere 6 timer ved 30 grader celsius under omrøring ved 200 rotationer pr. Minut. Der opsamles en ml cellekultur ved centrifugering ved 800 g i 5 minutter, og supernatanten kasseres.Resuspender cellepillen forsigtigt i 30 mikroliter destilleret vand. Forbered en agarose gel pad på et glas dias. Resuspender cellerne og læg fem mikroliter af celleopslæmningen på glasglasset, og dæk cellerne ved hjælp af den skårne agarosepude til undersøgelse.For at udføre mikroskopisk billeddannelse med et 100x mål skal du bruge skærmoptagelsesindstillingen til at generere billeder ved hjælp af programmet og vælge brightfield for at fokusere cellen med et 100x mål ved hjælp af nedsænkningsolie. Skift til et GFP-fluorescensfilter, og juster billedeksponeringstiden til mellem 50 millisekund og 300 millisekund for at opnå et klart billede ved at afbalancere signal-støj-forholdet. Åbn billedfilen, og analyser dataene ved at tælle cellerne baseret på antallet af foci i cellerne ved hjælp af billedanalysesoftware.Synucleinekspressionen under Gal1-promotoren i PRS426-vektoren viste signifikant væksthæmning på agarpladen indeholdende galactose som inducer. Forskellen i vækst ved synucleinekspression blev også observeret i flydende kulturer. Under begge dyrkningsbetingelser viste vildtype synuclein og varianter med E46K- eller A53T-mutationer vækstdefekter på grund af synucleintoksicitet.Imidlertid viste synuclein A30p-varianten, som ikke danner aggregater, en ikke-toksisk fænotype. De stammer, der udviste alvorlig cytotoksicitet, viste fokus på synucleinaggregater, men i A30p-varianten blev en mindre toksisk form for synuclein diffunderet gennem cellerne. For at opnå reproducerbare resultater er det vigtigt at bruge cellen i samme vækststadium i hvert eksperiment, især når du overvåger synucleinassocierede fænotyper.Som vi har vist i fluorescerende mikroskopdata, kan synuclein danne større aggregater. Derfor kan det simpelthen fraktioneres ved centrifugering og kan kvantificeres ved western blotting ved anvendelse af synucleinspecifikt antistof. Denne teknik kan anvendes til high-throughput screening for at finde nye genetiske faktorer og kemiske forbindelser, der påvirker aggregeringen af synuclein.Således håber vi at finde nye terapeutiske kandidater til Parkinsons sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Vækstassays til Vurdere polyglutamine Toksicitet i gær

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generering af en &quot;humaniseret&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellelinie Følsom over for Farmakologisk Inhibering af kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Brug af en helmonteret immunhistokemisk metode til at studere indervation af galdevejen i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse ændringer i iboende Protein sammenlægning med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...