Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

We bedanken James Bardwell en Tiago F. Outeiro voor het delen van de plasmiden die α-synucleïne bevatten. Changhan Lee ontving financiering van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (subsidie 2021R1C1C1011690), het Basic Science Research Program via de NRF gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (subsidie 2021R1A6A1A1A10044950) en het nieuwe facultaire onderzoeksfonds van Ajou University.

1. Voorbereiding van media en oplossingen
<ol><li>Media voorbereiding<ol><li>Om YPD-medium te bereiden, lost u 50 g YPD-poeder op in dH2O om een laatste volume van 1 L. Autoclaaf voor sterilisatie te maken. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Om YPD agar medium te maken, lost u 50 g YPD-poeder en 20 g agar op in 1 L dH2O. Autoclaaf voor sterilisatie. Na het afkoelen op petrischalen gieten. Bewaren bij 4 °C.</li>
		<li>Om SC te maken met raffinose (SRd)-Ura medium, los 6...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Gezien de complexiteit van verschillende cellulaire systemen bij mensen, is het voordelig om gist te gebruiken als een model voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hoewel het bijna onmogelijk is om de complexe cellulaire interacties van het menselijk brein met behulp van gist te onderzoeken, hebben gistcellen vanuit een eencellig perspectief een hoge mate van gelijkenis met menselijke cellen in termen van de genomische sequentie homologie en fundamentele eukaryote cellulaire processen<sup class="x...

De ziekte van Parkinson (PD) is een ernstig probleem voor vergrijzende samenlevingen wereldwijd. De aggregatie van α-synucleïne is nauw verbonden met PD en eiwitaggregaten van α-synucleïne worden veel gebruikt als moleculaire biomarker voor het diagnosticeren van de ziekte1. α-synucleïne is een klein zuur eiwit (140 aminozuren lang) met drie domeinen, namelijk de N-terminale lipide-bindende α-helix, het amyloïde-bindende centrale domein (NAC) en de C-terminale zure staart2. Het verkeerd vouwen van α-synucleïne kan spontaan optreden en leidt uiteindelijk tot de vorming van amyloïde aggregaten genaamd Lewy bodies3. α-synucleïne kan op verschillende manieren bijdragen aan de pathogenese van PD. Over het algemeen wordt gedacht dat de abnormale, oplosbare oligomere vormen die protofibrillen worden genoemd, toxische soorten zijn die neuronale celdood veroorzaken door verschillende cellulaire doelen te beïnvloeden, waaronder synaptische functie3.
De biologische modellen die worden gebruikt om neurodegeneratieve ziekten te bestuderen, moeten relevant zijn voor mensen met betrekking tot hun genoom en cellulaire biologie. De beste modellen zouden menselijke neuronale cellijnen zijn. Deze cellijnen worden echter geassocieerd met verschillende technische problemen, zoals problemen bij het onderhoud van culturen, lage efficiëntie van transfectie en hoge kosten4. Om deze redenen is een eenvoudig en betrouwbaar instrument nodig om de vooruitgang op dit onderzoeksgebied te versnellen. Belangrijk is dat de tool gemakkelijk te gebruiken moet zijn voor het analyseren van de verzamelde gegevens. Vanuit deze perspectieven zijn verschillende modelorganismen op grote schaal gebruikt, waaronder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gist en knaagdieren5. Onder hen is gist het beste modelorganisme omdat genetische manipulatie gemakkelijk is en goedkoper is dan de andere modelorganismen. Het belangrijkste is dat gist hoge overeenkomsten heeft met menselijke cellen, zoals 60% sequentie homologie aan menselijke orthologen en 25% nauwe homologie met menselijke ziekte-gerelateerde genen6, en ze delen ook fundamentele eukaryote celbiologie. Gist bevat veel eiwitten met vergelijkbare sequenties en analoge functies als die in menselijke cellen7. Inderdaad, gist die menselijke genen tot expressie brengt, is op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om cellulaire processen op tehelderen 8. Deze giststam wordt gehumaniseerde gist genoemd en is een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de functie van menselijke genen9. Gehumaniseerde gist heeft verdienste voor het bestuderen van genetische interacties omdat genetische manipulatie goed ingeburgerd is in gist.
In deze studie gebruikten we de gist Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme om de pathogenese van PD te bestuderen, met name voor het onderzoeken van α-synucleïne aggregaatvorming en cytotoxiciteit10. Voor de expressie van α-synucleïne in de ontluikende gist, werd de W303a-stam gebruikt voor transformatie met plasmiden die coderen voor de wild-type en familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne. Aangezien de W303a-stam een auxotrofe mutatie op URA3 heeft, is deze van toepassing op de selectie van cellen die plasmiden met URA3 bevatten. De expressie van α-synucleïne gecodeerd in een plasmide wordt gereguleerd onder de GAL1 promotor. Zo kan het expressieniveau van α-synucleïne worden gecontroleerd. Bovendien maakt de fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in het C-terminale gebied van α-synucleïne de monitoring van α-synucleïne foci-vorming mogelijk. Om de kenmerken van de familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne te begrijpen, drukten we deze varianten ook uit in gist en onderzochten we hun cellulaire effecten. Dit systeem is een eenvoudig hulpmiddel voor het screenen van verbindingen of genen die beschermende rollen vertonen tegen de cytotoxiciteit van α-synucleïne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

De ziekte van Parkinson is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening en wordt gekenmerkt door progressieve celdood veroorzaakt door de vorming van Lewy-lichamen die verkeerd gevouwen en geaggregeerde α-synucleïne bevatten. α-synucleïne is een overvloedig presynaptisch eiwit dat de handel in synaptische blaasjes reguleert, maar de accumulatie van de eiwithoudende insluitsels resulteert in neurotoxiciteit. Recente studies hebben aangetoond dat verschillende genetische factoren, waaronder bacteriële chaperonnes, de vorming van α-synucleïneaggregaten in vitro kunnen verminderen. Het is echter ook belangrijk om het anti-aggregatie-effect in de cel te monitoren om dit toe te passen als een potentiële behandeling voor de patiënten. Het zou ideaal zijn om neuronale cellen te gebruiken, maar deze cellen zijn moeilijk te hanteren en het duurt lang om het anti-aggregatiefenotype te vertonen. Daarom is een snel en effectief in vivo instrument nodig voor de verdere evaluatie van de in vivo anti-aggregatieactiviteit. De hier beschreven methode werd gebruikt om het anti-aggregatiefenotype in de gehumaniseerde gist Saccharomyces cerevisiae, die menselijke α-synucleïne tot expressie bracht, te controleren en te analyseren. Dit protocol demonstreert in vivo hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt voor het monitoren van α-synucleïne-geïnduceerde cellulaire toxiciteit, evenals de vorming van α-synucleïneaggregaten in cellen.

Van de hoge expressie van α-synucleïne is bekend dat deze verband houdt met neuronale celdood en PD in modelsystemen van PD. Deze studie beschrijft drie methoden om de cytotoxiciteit van α-synucleïne en de focivorming van geaggregeerde α-synucleïne in gist te monitoren. Hier werd de α-synucleïne overexpressie in gist en werden de fenotypen van wild-type α-synucleïne en drie varianten van α-synucleïne bekend als familiale mutanten van PD onderzocht (figuur 1 en de tabel me...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Dit is een eenvoudige methode om cellulaire fenotypen en kenmerken van R-pass-kernen te controleren. Het kan ook vaak worden teruggevonden in genoombrede studie om de genetische factoren te vinden die de stabiliteit van R-pass-kernen beïnvloeden. Omdat dit een goed ingeburgerd motorisch organisme is, is deze techniek eenvoudig en vereist het niet veel tijd en moeite in vergelijking met het gebruik van menselijke cellijnen of diermodellen.De aggregatie van R-pass kernen is nauw verbonden met de ziekte van Parkinson. De eiwitten of chemicaliën die waarschijnlijk de stabiliteit van R-pass kernen beïnvloeden, kunnen worden getest in dit gehumaniseerde gistmodel. Om te beginnen, patch drie enkele kolonies op een SD-URA agar plaat voor de selectie van cellen die alfa-synucleïne plasmiden bevatten.Ent vervolgens de drie-gepatchte gisttransformatoren per stam in 3 milliliter SRD-URA voor de selectieve groei van gist die de plasmiden bevat met 2% raffinose voor remming van de inductie van alfa-synucleïne onder de Gal1-promotor en 0,1% glucose. Incubeer de geënte cultuur bij 30 graden celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Ent de volgende dag de nachtelijk gekweekte cellen in 3 milliliter verse SRD-URA totdat ze een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nanometer bereiken.Incubeer vervolgens de cultuur gedurende zes uur bij 30 graden celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Verdun vervolgens de monsters tot een optische dichtheid van 0,5 op 600 nanometer met steriel gedestilleerd water in baan 1 van een 96-well plaat om het aantal cellen in elke cultuur gelijk te trekken.Voer 5-voudige seriële verdunningen van de gistcellen uit door 160 microliter steriel gedestilleerd water toe te voegen aan de volgende vijf rijstroken en zorg voor een totaal volume van 40 microliter bij het serieel verdunnen van de cellen in elke baan. Gebruik een meerkanaals pipet om 10 microliter uit elke put over te brengen om de monsters op SD-URA agarplaten voor de controles en SG-URA agarplaten om de toxiciteit te controleren te spotten. Incubeer de gevlekte platen ondersteboven bij 30 graden celsius gedurende vier dagen.Maak elke 24 uur tot dag vier foto's van de platen en analyseer vervolgens de gegevens door de groeiverschillen tussen met het oog gespotte stammen te vergelijken. Ent de drie gepatchte gisttransformatoren per stam in drie milliliter SRD-URA en incubeer bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 omwentelingen per minuut per nacht. Meet de volgende dag de optische dichtheid van de cellen die 's nachts op 600 nanometer zijn gekweekt en ent de cellen in totaal 200 microliter verse SD-URA en SG-URA in 96-well platen.Pas het uiteindelijke volume inclusief de cellen aan op 200 microliter en pas de initiële optische celdichtheid aan op 0,05 bij 600 nanometer. Pas de programma-instellingen in de microtiterplaat aan. Stel de doeltemperatuur in op 30 graden Celsius, de intervaltijd op 15 minuten, de schudduur op 890 seconden, de schudamplitude op 5 millimeter en de meting als absorptie op 600 nanometer.Incubeer de plaat gedurende 2-3 dagen voor alle stammen om de stationaire fase in een microplaatlezer te bereiken. Analyseer de gegevens door de groeicurve uit te zetten. Ent de gepatchte gisttransformaties in 3 milliliter SRD-URA en kweek ze 's nachts op 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut.Ent de volgende dag de 's nachts gekweekte cellen opnieuw in 3 milliliter verse SRD-URA tot een optische dichtheid van 0,003 op 600 nanometer en incubeer vervolgens de cultuur bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut, totdat de optische dichtheid 0,2 bereikt. Voeg vervolgens 300 microliter 20% galactose toe en incubeer vervolgens nog eens 6 uur bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Verzamel een milliliter van de celcultuur door centrifugeren bij 800 g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.Resuspenseer de celpellet voorzichtig in 30 microliter gedestilleerd water. Bereid een agarose gel pad op een glazen glijbaan. Resuspendeer de cellen en laad vijf microliter van de cel resuspensie op de glasplaat en bedek de cellen met behulp van de gesneden agarose pad voor onderzoek.Om microscopische beeldvorming uit te voeren met een 100x-objectief, gebruikt u de optie voor het vastleggen van schermen voor het genereren van afbeeldingen met behulp van het programma en selecteert u brightfield om de cel scherp te stellen met een 100x-objectief met behulp van dompelolie. Schakel over naar een GFP-fluorescentiefilter en pas de belichtingstijd van het beeld aan tot tussen 50 milliseconden en 300 milliseconden om een helder beeld te verkrijgen door de signaal-ruisverhouding in evenwicht te brengen. Open het afbeeldingsbestand en analyseer de gegevens door de cellen te tellen op basis van het aantal foci in de cellen met behulp van beeldanalysesoftware.De synucleïne-expressie onder de Gal1-promotor in de PRS426-vector vertoonde een significante groeivertraging op de agarplaat met galactose als inductor. Het verschil in groei door synucleïneexpressie werd ook waargenomen in vloeibare culturen. In beide kweekomstandigheden vertoonden wild-type synucleïne en varianten met E46K- of A53T-mutaties groeidefecten als gevolg van synucleïnetoxiciteit.De synucleïne A30p-variant, die geen aggregaten vormt, vertoonde echter een niet-toxisch fenotype. De stammen die ernstige cytotoxiciteit vertoonden, vertoonden foci van synucleïneaggregaten, maar in de A30p-variant werd een minder toxische vorm van synucleïne door de cellen verspreid. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, is het belangrijk om de cel in elk experiment in dezelfde groeifase te gebruiken, vooral wanneer u synucleïne-geassocieerde fenotypen monitort.Zoals we hebben aangetoond in fluorescerende microscoopgegevens, kan synucleïne grotere aggregaten vormen. Daarom kan het eenvoudig worden gefractioneerd door centrifugatie en kan het worden gekwantificeerd door western blotting met behulp van synucleïne-specifiek antilichaam. Deze techniek is toepasbaar voor high-throughput screening om nieuwe genetische factoren en chemische verbindingen te vinden die de aggregatie van synucleïne beïnvloeden.Zo hopen we nieuwe therapeutische kandidaten voor de ziekte van Parkinson te vinden.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...