Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
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Nous remercions James Bardwell et Tiago F. Outeiro d’avoir bien voulu partager les plasmides contenant de la α-synucléine. Changhan Lee a reçu un financement de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (subvention 2021R1C1C1011690), du Programme de recherche scientifique fondamentale par le biais de la NRF financé par le ministère de l’Éducation (subvention 2021R1A6A1A10044950) et du nouveau fonds de recherche du corps professoral de l’Université Ajou.

1. Préparation des supports et des solutions
<ol><li>Préparation des médias<ol><li>Pour préparer le milieu YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD dansdH2Opour obtenir un volume final de 1 L. Autoclave pour stérilisation. Conserver à température ambiante (RT).</li>
		<li>Pour fabriquer un milieu gélosé YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD et 20 g de gélose dans 1 L dedH2O. Autoclave pour stérilisation. Après refroidissement, verser sur des boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.<...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Compte tenu de la complexité des différents systèmes cellulaires chez l’homme, il est avantageux d’utiliser la levure comme modèle pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Bien qu’il soit presque impossible d’étudier les interactions cellulaires complexes du cerveau humain à l’aide de levure, d’un point de vue unicellulaire, les cellules de levure présentent un niveau élevé de similitude avec les cellules humaines en termes d’homologie de séquence génomique et de processus cellu...

La maladie de Parkinson (MP) est un problème grave pour les sociétés vieillissantes du monde entier. L’agrégation de la α-synucléine est étroitement associée à la MP, et les agrégats protéiques de α-synucléine sont largement utilisés comme biomarqueur moléculaire pour diagnostiquer la maladie1. α-synucléine est une petite protéine acide (140 acides aminés de longueur) avec trois domaines, à savoir la α-hélice de liaison lipidique N-terminale, le domaine central de liaison amyloïde (NAC) et la queue acide C-terminale2. Le mauvais repliement de la α-synucléine peut se produire spontanément et conduit éventuellement à la formation d’agrégats amyloïdes appelés corps de Lewy3. α-synucléine peut contribuer à la pathogenèse de la MP de plusieurs façons. En général, on pense que ses formes oligomères anormales et solubles appelées protofibrilles sont des espèces toxiques qui provoquent la mort des cellules neuronales en affectant diverses cibles cellulaires, y compris la fonction synaptique3.
Les modèles biologiques utilisés pour étudier les maladies neurodégénératives doivent être pertinents pour les humains en ce qui concerne leur génome et leur biologie cellulaire. Les meilleurs modèles seraient des lignées cellulaires neuronales humaines. Cependant, ces lignées cellulaires sont associées à plusieurs problèmes techniques, tels que des difficultés dans le maintien des cultures, une faible efficacité de la transfection et des dépenses élevées4. Pour ces raisons, un outil simple et fiable est nécessaire pour accélérer les progrès dans ce domaine de recherche. Il est important de noter que l’outil doit être facile à utiliser pour analyser les données collectées. De ce point de vue, divers organismes modèles ont été largement utilisés, notamment la drosophile, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, la levure et les rongeurs5. Parmi eux, la levure est le meilleur organisme modèle car la manipulation génétique est facile et moins chère que les autres organismes modèles. Plus important encore, la levure présente de grandes similitudes avec les cellules humaines, telles que 60% d’homologie de séquence avec les orthologues humains et 25% d’homologie étroite avec les gènes liés à la maladie humaine6, et elles partagent également la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. La levure contient de nombreuses protéines avec des séquences similaires et des fonctions analogues à celles des cellules humaines7. En effet, la levure exprimant des gènes humains a été largement utilisée comme système modèle pour élucider les processus cellulaires8. Cette souche de levure est appelée levure humanisée et est un outil utile pour explorer la fonction des gènes humains9. La levure humanisée a le mérite d’étudier les interactions génétiques parce que la manipulation génétique est bien établie dans la levure.
Dans cette étude, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle pour étudier la pathogenèse de la MP, en particulier pour étudier la formation d’agrégats de α-synucléine et la cytotoxicité10. Pour l’expression de la α-synucléine dans la levure bourgeonnante, la souche W303a a été utilisée pour la transformation avec des plasmides codant pour les variantes de type sauvage et familiales associées à la de la α-synucléine. Comme la souche W303a a une mutation auxotrophe sur URA3, elle est applicable pour la sélection de cellules contenant des plasmides avec URA3. L’expression de la α-synucléine codée dans un plasmide est régulée par le promoteur GAL1. Ainsi, le niveau d’expression de la α-synucléine peut être contrôlé. De plus, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la région C-terminale de la α-synucléine permet de surveiller la formation de foyers de α-synucléine. Pour comprendre les caractéristiques des variantes familiales associées à la MP de la α-synucléine, nous avons également exprimé ces variantes chez la levure et examiné leurs effets cellulaires. Ce système est un outil simple pour le criblage de composés ou de gènes présentant des rôles protecteurs contre la cytotoxicité de la α-synucléine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente et se caractérise par une mort cellulaire progressive causée par la formation de corps de Lewy contenant de la α-synucléine mal repliée et agrégée. α-synucléine est une protéine présynaptique abondante qui régule le trafic des vésicules synaptiques, mais l’accumulation de ses inclusions protéiques entraîne une neurotoxicité. Des études récentes ont révélé que divers facteurs génétiques, y compris les chaperons bactériens, pourraient réduire la formation d’agrégats de α-synucléine in vitro. Cependant, il est également important de surveiller l’effet anti-agrégation dans la cellule pour l’appliquer comme traitement potentiel pour les patients. Il serait idéal d’utiliser des cellules neuronales, mais ces cellules sont difficiles à manipuler et prennent beaucoup de temps à présenter le phénotype anti-agrégation. Par conséquent, un outil in vivo rapide et efficace est nécessaire pour une évaluation plus approfondie de l’activité anti-agrégation in vivo. La méthode décrite ici a été utilisée pour surveiller et analyser le phénotype anti-agrégation de la levure humanisée Saccharomyces cerevisiae, qui exprimait la α-synucléine humaine. Ce protocole démontre des outils in vivo qui pourraient être utilisés pour surveiller la toxicité cellulaire induite par la α-synucléine, ainsi que la formation d’agrégats de α-synucléine dans les cellules.

La forte expression de la α-synucléine est connue pour être liée à la mort cellulaire neuronale et à la MP dans les systèmes modèles de MP. Cette étude décrit trois méthodes pour surveiller la cytotoxicité de la α-synucléine et la formation de foyers de α-synucléine agrégée dans la levure. Ici, la α-synucléine a été surexprimée dans la levure, et les phénotypes de la α-synucléine de type sauvage et de trois variantes de la α-synucléine connues sous le nom de mutants familiaux de la MP ont ét?...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.

Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Il s’agit d’une méthode simple pour surveiller les phénotypes cellulaires et les caractéristiques des noyaux R-passe. Il peut également être souvent récupéré dans une étude à l’échelle du génome pour trouver les facteurs génétiques affectant la stabilité des noyaux R-pass. Comme il s’agit d’un organisme moteur bien établi, cette technique est facile et ne nécessite pas beaucoup de temps et d’efforts par rapport à l’utilisation de lignées cellulaires humaines ou de modèles animaux.L’agrégation des noyaux R-pass est étroitement associée à la maladie de Parkinson. Les protéines ou les produits chimiques susceptibles d’affecter la stabilité des noyaux R-pass peuvent être testés dans ce modèle de levure humanisée. Pour commencer, appliquez trois colonies simples sur une plaque de gélose SD-URA pour la sélection de cellules contenant des plasmides alpha-synucléines.Ensuite, inoculer les transformants de levure à trois patchs par souche dans 3 millilitres de SRD-URA pour la croissance sélective de levures contenant les plasmides avec 2% de raffinose pour l’inhibition de l’induction de l’alpha-synucléine sous le promoteur Gal1 et 0,1% de glucose. Incuber la culture inoculée à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Le lendemain, inoculez les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 millilitres de SRD-URA frais jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de 0,2 à 600 nanomètres.Ensuite, incuber la culture pendant six heures à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Mesurer la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, diluez les échantillons à une densité optique de 0,5 à 600 nanomètres avec de l’eau distillée stérile dans la voie 1 d’une plaque de 96 puits pour égaliser le nombre de cellules dans chaque culture.Effectuez des dilutions en série 5 fois des cellules de levure en ajoutant 160 microlitres d’eau distillée stérile aux cinq voies suivantes et assurez un volume total de 40 microlitres lors de la dilution en série des cellules dans chaque voie. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 10 microlitres de chaque puits afin de repérer les échantillons sur les plaques de gélose SD-URA pour les témoins et les plaques de gélose SG-URA pour surveiller la toxicité. Incuber les plaques tachetées à l’envers à 30 degrés Celsius pendant quatre jours.Prenez des images des plaques toutes les 24 heures jusqu’au quatrième jour, puis analysez les données en comparant les différences de croissance entre les souches repérées à l’œil. Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche en trois millilitres de SRD-URA et incuber à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain, mesurez la densité optique des cellules cultivées pendant la nuit à 600 nanomètres et inoculez les cellules dans un total de 200 microlitres de SD-URA et SG-URA frais dans des plaques de 96 puits.Ajustez le volume final, y compris les cellules, à 200 microlitres et ajustez la densité optique initiale de la cellule à 0,05 à 600 nanomètres. Ajustez les paramètres du programme dans la plaque de microtitration. Réglez la température cible à 30 degrés Celsius, l’intervalle de temps à 15 minutes, la durée de secousse à 890 secondes, l’amplitude de secousse à 5 millimètres et la mesure à 600 nanomètres.Incuber la plaque pendant 2-3 jours pour que toutes les souches atteignent la phase stationnaire dans un lecteur de microplaques. Analysez les données en traçant la courbe de croissance. Inoculer les transformants de levure rapiécés en 3 millilitres de SRD-URA et les cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute.Le lendemain, inoculer à nouveau les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 millilitres de SRD-URA frais à une densité optique de 0,003 à 600 nanomètres, puis incuber la culture à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute, jusqu’à ce que la densité optique atteigne 0,2. Ajoutez ensuite 300 microlitres de 20% de galactose, puis incuber pendant encore 6 heures à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Prélever un millilitre de la culture cellulaire par centrifugation à 800 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant.Remettez délicatement en suspension la pastille cellulaire dans 30 microlitres d’eau distillée. Préparez un tampon de gel agarose sur une lame de verre. Remettez les cellules en suspension et chargez cinq microlitres de la suspension cellulaire sur la lame de verre, et couvrez les cellules à l’aide du tampon d’agarose coupé pour examen.Pour effectuer une imagerie microscopique avec un objectif 100x, utilisez l’option de capture d’écran pour générer des images à l’aide du programme et sélectionnez le fond clair pour focaliser la cellule avec un objectif 100x à l’aide d’huile d’immersion. Passez à un filtre à fluorescence GFP et réglez le temps d’exposition de l’image entre 50 millisecondes et 300 millisecondes pour obtenir une image claire en équilibrant le rapport signal sur bruit. Ouvrez le fichier image et analysez les données en comptant les cellules en fonction du nombre de foyers dans les cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.L’expression de synucléine sous le promoteur Gal1 dans le vecteur PRS426 a montré un retard de croissance significatif sur la plaque de gélose contenant du galactose comme inducteur. La différence de croissance par expression de synucléine a également été observée dans des cultures liquides. Dans les deux conditions de culture, la synucléine de type sauvage et les variantes présentant des mutations E46K ou A53T ont montré des défauts de croissance dus à la toxicité de la synucléine.Cependant, la variante de la synucléine A30p, qui ne forme pas d’agrégats, a montré un phénotype non toxique. Les souches présentant une cytotoxicité sévère ont montré des foyers d’agrégats de synucléine, mais dans la variante A30p, une forme moins toxique de synucléine a été diffusée dans les cellules. Pour obtenir des résultats reproductibles, il est important d’utiliser la cellule au même stade de croissance dans chaque expérience, en particulier lorsque vous surveillez les phénotypes associés à la synucléine.Comme nous l’avons montré dans les données de microscope fluorescent, la synucléine peut former des agrégats plus importants. Par conséquent, il peut être simplement fractionné par centrifugation et peut être quantifié par Western blot à l’aide d’anticorps spécifiques de la synucléine. Cette technique est applicable au criblage à haut débit pour trouver de nouveaux facteurs génétiques et composés chimiques affectant l’agrégation de la synucléine.Ainsi, nous espérons trouver de nouveaux candidats thérapeutiques pour la maladie de Parkinson.

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