Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
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Wir danken James Bardwell und Tiago F. Outeiro für die freundliche Bereitstellung der Plasmide, die α-Synuclein enthalten. Changhan Lee erhielt Fördermittel von der National Research Foundation of Korea (NRF), die von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wurde (Grant 2021R1C1C1011690), dem Basic Science Research Program durch das NRF, das vom Bildungsministerium finanziert wurde (Grant 2021R1A6A1A10044950) und dem neuen Fakultätsforschungsfonds der Ajou University.

1. Aufbereitung von Medien und Lösungen
<ol><li>Medienaufbereitung<ol><li>Zur Herstellung des YPD-Mediums werden 50 g YPD-Pulver in dH2O gelöst, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.</li>
		<li>Um YPD-Agarmedium herzustellen, lösen Sie 50 g YPD-Pulver und 20 g Agar in 1 L dH2O. Autoklav zur Sterilisation. Nach dem Abkühlen auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Zur Herstellung von SC mit Raffinose (SRd)-Ura-Medium werden 6,7 g H...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. 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F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Angesichts der Komplexität verschiedener zellulärer Systeme beim Menschen ist es vorteilhaft, Hefe als Modell für die Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden. Obwohl es nahezu unmöglich ist, die komplexen zellulären Interaktionen des menschlichen Gehirns mit Hilfe von Hefe zu untersuchen, weisen Hefezellen aus Einzelzellperspektive eine hohe Ähnlichkeit mit menschlichen Zellen in Bezug auf die genomische Sequenzhomologie und grundlegende eukaryotische zelluläre Prozesse auf<sup class...

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet1. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz2. Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, die als Lewy-Körper3 bezeichnet werden. α-Synuclein kann auf verschiedene Weise zur Pathogenese der Parkinson-Krankheit beitragen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass seine abnormalen, löslichen oligomeren Formen, die Protofibrillen genannt werden, toxische Spezies sind, die den neuronalen Zelltod verursachen, indem sie verschiedene zelluläre Ziele, einschließlich der synaptischen Funktion3, beeinflussen.
Die biologischen Modelle, mit denen neurodegenerative Erkrankungen untersucht werden, müssen für den Menschen in Bezug auf sein Genom und seine Zellbiologie relevant sein. Die besten Modelle wären menschliche neuronale Zelllinien. Diese Zelllinien sind jedoch mit mehreren technischen Problemen verbunden, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung von Kulturen, geringer Effizienz der Transfektion und hohen Kosten4. Aus diesen Gründen ist ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug erforderlich, um den Fortschritt in diesem Forschungsbereich zu beschleunigen. Wichtig ist, dass das Tool für die Analyse der gesammelten Daten einfach zu bedienen ist. Aus dieser Perspektive wurden verschiedene Modellorganismen weit verbreitet, darunter Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, Hefe und Nagetiere5. Unter ihnen ist Hefe der beste Modellorganismus, weil genetische Manipulation einfach und billiger ist als die anderen Modellorganismen. Am wichtigsten ist, dass Hefe hohe Ähnlichkeiten mit menschlichen Zellen aufweist, wie z.B. 60% Sequenzhomologie zu menschlichen Orthologen und 25% enge Homologie mit menschlichen krankheitsbezogenen Genen6, und sie teilen auch eine grundlegende eukaryotische Zellbiologie. Hefe enthält viele Proteine mit ähnlichen Sequenzen und ähnlichen Funktionen wie in menschlichen Zellen7. In der Tat wurde Hefe, die menschliche Gene exprimiert, häufig als Modellsystem zur Aufklärung zellulärer Prozesse verwendet8. Dieser Hefestamm wird als humanisierte Hefe bezeichnet und ist ein nützliches Werkzeug, um die Funktion menschlicher Gene zu erforschen9. Humanisierte Hefe hat Vorteile für die Untersuchung genetischer Interaktionen, da die genetische Manipulation in Hefe gut etabliert ist.
In dieser Studie haben wir die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen, insbesondere um die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten und die Zytotoxizität zu untersuchen10. Für die Expression von α-Synuclein in der Knospungshefe wurde der W303a-Stamm zur Transformation mit Plasmiden verwendet, die für die Wildtyp- und familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein kodieren. Da der W303a-Stamm eine auxotrophe Mutation auf URA3 aufweist, ist er für die Selektion von Zellen geeignet, die Plasmide mit URA3 enthalten. Die Expression von α-Synuclein, das in einem Plasmid kodiert ist, wird unter dem GAL1-Promotor reguliert. So kann das Expressionsniveau von α-Synuclein gesteuert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Fusion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) an der C-terminalen Region von α-Synuclein die Überwachung der Bildung von α-Synuclein-Herden. Um die Eigenschaften der familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein zu verstehen, haben wir diese Varianten auch in Hefe exprimiert und ihre zellulären Wirkungen untersucht. Dieses System ist ein einfaches Werkzeug für das Screening von Verbindungen oder Genen, die eine schützende Rolle gegen die Zytotoxizität von α-Synuclein spielen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

Die Parkinson-Krankheit ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Zelltod, der durch die Bildung von Lewy-Körperchen verursacht wird, die fehlgefaltetes und aggregiertes α-Synuclein enthalten. α-Synuclein ist ein reichlich vorhandenes präsynaptisches Protein, das den synaptischen Vesikeltransport reguliert, aber die Anhäufung seiner proteinartigen Einschlüsse führt zu Neurotoxizität. Neuere Studien haben gezeigt, dass verschiedene genetische Faktoren, einschließlich bakterieller Chaperone, die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in vitro reduzieren könnten. Es ist jedoch auch wichtig, den Anti-Aggregationseffekt in der Zelle zu überwachen, um dies als mögliche Behandlung für die Patienten anzuwenden. Es wäre ideal, neuronale Zellen zu verwenden, aber diese Zellen sind schwer zu handhaben und brauchen lange, um den Anti-Aggregations-Phänotyp zu zeigen. Daher ist ein schnelles und effektives In-vivo-Tool für die weitere Bewertung der In-vivo-Antiaggregationsaktivität erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um den Anti-Aggregationsphänotyp in der humanisierten Hefe Saccharomyces cerevisiae zu überwachen und zu analysieren, der humanes α-Synuclein exprimierte. Dieses Protokoll demonstriert In-vivo-Werkzeuge, die zur Überwachung der α-Synuclein-induzierten zellulären Toxizität sowie der Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in Zellen verwendet werden könnten.

Es ist bekannt, dass die hohe Expression von α-Synuclein mit dem neuronalen Zelltod und der Parkinson-Krankheit in Modellsystemen der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Diese Studie beschreibt drei Methoden zur Überwachung der Zytotoxizität von α-Synuclein und der Bildung von aggregiertem α-Synuclein in Hefe. Hier wurde das α-Synuclein in Hefe überexprimiert, und die Phänotypen von Wildtyp-α-Synuclein und drei Varianten von α-Synuclein, die als familiäre Mutanten von PD bekannt sind, wurden unter...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Dies ist eine einfache Methode, um zelluläre Phänotypen und Merkmale von R-Pass-Kernen zu überwachen. Es kann auch oft in genomweiten Studien gewonnen werden, um die genetischen Faktoren zu finden, die die Stabilität von R-Pass-Kernen beeinflussen. Da es sich um einen gut etablierten motorischen Organismus handelt, ist diese Technik einfach und erfordert nicht viel Zeit und Mühe im Vergleich zur Verwendung von menschlichen Zelllinien oder Tiermodellen.Die Aggregation von R-Pass-Kernen ist eng mit der Parkinson-Krankheit verbunden. Die Proteine oder Chemikalien, die wahrscheinlich die Stabilität von R-Pass-Kernen beeinflussen, können in diesem humanisierten Hefemodell getestet werden. Zu Beginn werden drei einzelne Kolonien auf eine SD-URA-Agarplatte gepatcht, um Zellen auszuwählen, die Alpha-Synuclein-Plasmide enthalten.Dann werden die dreigepatchten Hefetransformanten pro Stamm in 3 Milliliter SRD-URA für das selektive Wachstum von Hefe, die die Plasmide enthält, mit 2% Raffinose zur Hemmung der Induktion von Alpha-Synuclein unter dem Gal1-Promotor und 0,1% Glukose beimpft. Inkubieren Sie die beimpfte Kultur bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Tag impfen Sie die über Nacht kultivierten Zellen in 3 Milliliter frisches SRD-URA, bis sie eine optische Dichte von 0,2 bei 600 Nanometern erreichen.Dann inkubieren Sie die Kultur für sechs Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometer mit einem Spektralphotometer. Als nächstes verdünnen Sie die Proben auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern mit sterilem destilliertem Wasser in Spur 1 einer 96-Well-Platte, um die Anzahl der Zellen in jeder Kultur auszugleichen.Führen Sie 5-fache serielle Verdünnungen der Hefezellen durch, indem Sie 160 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in die nächsten fünf Bahnen geben und ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern sicherstellen, wenn die Zellen in jeder Spur seriell verdünnt werden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung zu übertragen, um die Proben auf SD-URA-Agarplatten für die Kontrollen und SG-URA-Agarplatten zur Überwachung der Toxizität zu erkennen. Inkubieren Sie die gefleckten Platten kopfüber bei 30 Grad Celsius für vier Tage.Nehmen Sie alle 24 Stunden bis zum vierten Tag Bilder von den Platten auf und analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Wachstumsunterschiede zwischen den vom Auge entdeckten Stämmen vergleichen. Die drei geflickten Hefetransformatoren pro Stamm werden in drei Milliliter SRD-URA geimpft und bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht inkubiert. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der über Nacht kultivierten Zellen auf 600 Nanometern und impfen Sie die Zellen in 96-Well-Platten in insgesamt 200 Mikroliter frisches SD-URA und SG-URA.Stellen Sie das Endvolumen einschließlich der Zellen auf 200 Mikroliter ein und stellen Sie die anfängliche optische Dichte der Zelle auf 0,05 bei 600 Nanometern ein. Passen Sie die Programmeinstellungen in der Mikrotiterplatte an. Stellen Sie die Solltemperatur auf 30 Grad Celsius, die Intervallzeit auf 15 Minuten, die Schütteldauer auf 890 Sekunden, die Schüttelamplitude auf 5 Millimeter und die Messung als Absorption auf 600 Nanometer ein.Inkubieren Sie die Platte für 2-3 Tage, damit alle Stämme die stationäre Phase in einem Mikroplatten-Reader erreichen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Wachstumskurve darstellen. Die geflickten Hefetransformatoren werden in 3 Milliliter SRD-URA geimpft und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute kultiviert.Am nächsten Tag werden die über Nacht kultivierten Zellen erneut in 3 Milliliter frisches SRD-URA auf eine optische Dichte von 0,003 bei 600 Nanometern injikuliert, dann die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert, bis die optische Dichte 0,2 erreicht. Dann fügen Sie 300 Mikroliter 20% Galaktose hinzu und inkubieren Sie dann weitere 6 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute. Einen Milliliter der Zellkultur durch Zentrifugieren bei 800 g für 5 Minuten auffangen und den Überstand entsorgen.Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 30 Mikroliter destilliertem Wasser. Bereiten Sie ein Agarose-Gel-Pad auf einem Objektträger vor. Resuspendieren Sie die Zellen und laden Sie fünf Mikroliter der Zellresuspension auf den Glasobjektträger und decken Sie die Zellen mit dem geschnittenen Agarose-Pad zur Untersuchung ab.Um eine mikroskopische Bildgebung mit einem 100-fachen Objektiv durchzuführen, verwenden Sie die Screen-Capture-Option zum Erzeugen von Bildern mit dem Programm und wählen Sie Hellfeld, um die Zelle mit einem 100-fachen Objektiv mit Immersionsöl zu fokussieren. Wechseln Sie zu einem GFP-Fluoreszenzfilter und stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 Millisekunden und 300 Millisekunden ein, um ein klares Bild zu erzielen, indem Sie das Signal-Rausch-Verhältnis ausgleichen. Öffnen Sie die Bilddatei und analysieren Sie die Daten, indem Sie die Zellen basierend auf der Anzahl der Herde in den Zellen mit einer Bildanalysesoftware zählen.Die Synuclein-Expression unter dem Gal1-Promotor im PRS426-Vektor zeigte eine signifikante Wachstumsverzögerung auf der Agarplatte, die Galactose als Induktor enthielt. Der Unterschied im Wachstum der Synuclein-Expression wurde auch in flüssigen Kulturen beobachtet. In beiden Kulturbedingungen zeigten Wildtyp-Synuclein und Varianten mit E46K- oder A53T-Mutationen Wachstumsdefekte aufgrund von Synuclein-Toxizität.Die Synuclein-A30p-Variante, die keine Aggregate bildet, zeigte jedoch einen nicht-toxischen Phänotyp. Die Stämme mit schwerer Zytotoxizität zeigten Herde von Synuclein-Aggregaten, aber in der A30p-Variante wurde eine weniger toxische Form von Synuclein in den Zellen diffundiert. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Zelle in jedem Experiment im gleichen Wachstumsstadium zu verwenden, insbesondere wenn Sie Synuclein-assoziierte Phänotypen überwachen.Wie wir in fluoreszierenden mikroskopischen Daten gezeigt haben, kann Synuclein größere Aggregate bilden. Daher kann es einfach durch Zentrifugation fraktioniert und durch Western Blotting unter Verwendung von Synuclein-spezifischen Antikörpern quantifiziert werden. Diese Technik ist für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, um neue genetische Faktoren und chemische Verbindungen zu finden, die die Aggregation von Synuclein beeinflussen.So hoffen wir, neue therapeutische Kandidaten für die Parkinson-Krankheit zu finden.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Forschung

Biologie

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...