Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

אנו מודים לג'יימס בארדוול וטיאגו פ. אוטיירו על שחלקו בחביבות את הפלסמידים המכילים α-סינוקלאין. צ'אנגהאן לי קיבל מימון מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מענק 2021R1C1C1011690), תוכנית המחקר המדעית הבסיסית באמצעות NRF במימון משרד החינוך (מענק 2021R1A6A1A10044950), וקרן המחקר החדשה של אוניברסיטת אג'ו.

1. הכנת מדיה ופתרונות
<ol><li>היערכות למדיה<ol><li>כדי להכין מדיום YPD, יש להמיס 50 גרם של אבקת YPD ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>כדי להפוך את האגר של YPD לבינוני, יש להמיס 50 גרם אבקת YPD ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר של dH2O. Autoclave לעיקור. לאחר שהתקרר, יוצקים על צ...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

בהתחשב במורכבות של מערכות תאיות שונות בבני אדם, כדאי להשתמש בשמרים כמודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. למרות שכמעט בלתי אפשרי לחקור את האינטראקציות התאיות המורכבות של המוח האנושי באמצעות שמרים, מנקודת מבט של תא בודד, לתאי שמרים יש רמה גבוהה של דמיון לתאים אנושיים במונחים של הומולוג...

מחלת פרקינסון (PD) היא בעיה רצינית עבור חברות מזדקנות ברחבי העולם. הצבירה של α-סינוקלאין קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון, ואגרגטים חלבוניים של α-סינוקלאין נמצאים בשימוש נרחב כסמן ביולוגי מולקולרי לאבחון המחלה1. α-סינוקלאין הוא חלבון חומצי קטן (140 חומצות אמינו באורך) בעל שלושה תחומים, כלומר סליל α קושר שומנים N, התחום המרכזי קושר עמילואיד (NAC) והזנב החומצי C-terminal2. קיפול שגוי של α-סינוקלאין יכול להתרחש באופן ספונטני ובסופו של דבר מוביל להיווצרות של אגרגטים עמילואידים הנקראים גופי לוי3. α-סינוקלאין עשוי לתרום לפתוגנזה של מחלת פרקינסון במספר דרכים. באופן כללי, הוא חשב כי צורות אוליגומריות חריגות ומסיסות הנקראות פרוטופיברילים הן מינים רעילים הגורמים למוות של תאי עצב על ידי השפעה על מטרות תאיות שונות, כולל תפקוד סינפטי3.
המודלים הביולוגיים המשמשים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות חייבים להיות רלוונטיים לבני אדם ביחס לגנום ולביולוגיה התאית שלהם. המודלים הטובים ביותר יהיו קווי תאים עצביים אנושיים. עם זאת, קווי תאים אלה קשורים למספר בעיות טכניות, כגון קשיים בתחזוקת תרביות, יעילות נמוכה של טרנספקציה והוצאות גבוהות4. מסיבות אלה נדרש כלי קל ואמין להאצת ההתקדמות בתחום מחקר זה. חשוב לציין, הכלי צריך להיות קל לשימוש לניתוח הנתונים שנאספו. מנקודות מבט אלה, אורגניזמי מודל שונים היו בשימוש נרחב, כולל דרוזופילה, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, שמרים ומכרסמים5. ביניהם, שמרים הוא אורגניזם המודל הטוב ביותר כי מניפולציה גנטית היא קלה, וזה זול יותר מאשר אורגניזמים מודל אחרים. והכי חשוב, לשמרים יש קווי דמיון גבוהים לתאים אנושיים, כגון 60% הומולוגיה של רצף לאורתולוגים אנושיים ו-25% הומולוגיה קרובה עם גנים הקשורים למחלות אנושיות6, והם גם חולקים ביולוגיה בסיסית של התא האאוקריוטי. שמרים מכילים חלבונים רבים בעלי רצפים דומים ותפקודים מקבילים לאלה שבתאים אנושיים7. ואכן, שמרים המבטאים גנים אנושיים נמצאים בשימוש נרחב כמערכת מודל להבהרת תהליכים תאיים8. זן שמרים זה נקרא שמרים אנושיים והוא כלי שימושי לחקר תפקודם של גנים אנושיים9. לשמרים אנושיים יש יתרון בחקר אינטראקציות גנטיות מכיוון שמניפולציה גנטית מבוססת היטב בשמרים.
במחקר זה השתמשנו בשמרים Saccharomyces cerevisiae כאורגניזם מודל לחקר הפתוגנזה של מחלת פרקינסון, במיוחד לחקר היווצרות אגרגטים α-סינוקלאין וציטוטוקסיות10. לביטוי של α-סינוקלאין בשמרים הניצנים, זן W303a שימש לטרנספורמציה עם קידוד פלסמידים עבור גרסאות PD מסוג בר ומשפחתיות של α-סינוקלאין. מכיוון שלזן W303a יש מוטציה אוקסוטרופית ב-URA3, הוא ישים לבחירת תאים המכילים פלסמידים עם URA3. הביטוי של α-סינוקלאין המקודד בפלסמיד מוסדר תחת מקדם GAL1. לפיכך, ניתן לשלוט ברמת הביטוי של α-סינוקלאין. בנוסף, היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באזור C-terminal של α-סינוקלאין מאפשר ניטור של היווצרות מוקדי α-סינוקלאין. כדי להבין את המאפיינים של הווריאנטים המשפחתיים הקשורים ל-PD של α-סינוקלאין, ביטאנו את הווריאנטים האלה גם בשמרים ובחנו את ההשפעות התאיות שלהם. מערכת זו היא כלי פשוט לסינון תרכובות או גנים המציגים תפקידי הגנה מפני ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

מחלת פרקינסון היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה ומאופיינת במוות תאי מתקדם הנגרם על ידי היווצרות גופי לוי המכילים α-סינוקלאין מקופלים ומצטברים. α-סינוקלאין הוא חלבון קדם-סינפטי בשפע המווסת את הסחר בשלפוחית הסינפטית, אך הצטברות התכלילים החלבניים שלו גורמת לרעילות עצבית. מחקרים אחרונים גילו כי גורמים גנטיים שונים, כולל מלווים חיידקיים, עשויים להפחית את היווצרותם של אגרגטים α-סינוקלאין במבחנה. עם זאת, חשוב גם לעקוב אחר אפקט אנטי צבירה בתא כדי ליישם את זה כטיפול פוטנציאלי עבור החולים. זה יהיה אידיאלי להשתמש בתאים עצביים, אבל תאים אלה קשה לטפל ולוקח הרבה זמן להציג את הפנוטיפ נגד צבירה. לכן, נדרש כלי in vivo מהיר ויעיל להערכה נוספת של פעילות אנטי-צבירה in vivo . השיטה המתוארת כאן שימשה לניטור וניתוח הפנוטיפ האנטי-צבירה בשמרים האנושיים Saccharomyces cerevisiae, שביטאו α-סינוקלאין אנושיים. פרוטוקול זה מדגים כלי in vivo שיכולים לשמש לניטור רעילות תאית הנגרמת על-ידי α-סינוקלאין, כמו גם להיווצרות אגרגטים α-סינוקלאין בתאים.

הביטוי הגבוה של α-סינוקלאין ידוע כקשור למוות תאי עצב ולפרקינסון במערכות מודל של מחלת פרקינסון. מחקר זה מתאר שלוש שיטות לניטור ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין והיווצרות מוקדים של α-סינוקלאין מצטברים בשמרים. כאן, הסינוקלאין α התבטא יתר על המידה בשמרים, ונבחנו הפנוטיפים של α-סינוקלאין מסוג בר ושל...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

זוהי שיטה פשוטה לניטור פנוטיפים תאיים ותכונות של גרעיני R-pass. לעתים קרובות ניתן גם לשחזר אותו במחקר כלל-גנומי כדי למצוא את הגורמים הגנטיים המשפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass. מכיוון שמדובר באורגניזם מוטורי מבוסס היטב, טכניקה זו קלה ואינה דורשת זמן ומאמץ רב בהשוואה לשימוש בקווי תאים אנושיים או במודלים של בעלי חיים.הצבירה של גרעיני R-pass קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון. ניתן לבדוק את החלבונים או הכימיקלים שככל הנראה משפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass במודל שמרים אנושי זה. כדי להתחיל, לתקן שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-URA לבחירת תאים המכילים פלסמידים אלפא-סינוקלאין.לאחר מכן, חסן את טרנספורמטורי השמרים בעלי שלושת התיקונים לכל זן ל-3 מיליליטר של SRD-URA לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב האינדוקציה של אלפא-סינוקלאין תחת מקדם Gal1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את התרבות המחוסנת ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. למחרת, חסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית של 0.2 ב-600 ננומטר.לאחר מכן, לדגור את התרבות במשך שש שעות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, דילל את הדגימות לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר עם מים מזוקקים סטריליים בנתיב 1 של לוח 96 בארות כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.בצע דילולים סדרתיים של פי 5 מתאי השמרים על ידי הוספת 160 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים לחמשת הנתיבים הבאים והבטח נפח כולל של 40 מיקרוליטר בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטרים מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-URA עבור הבקרות ולוחות אגר SG-URA כדי לנטר רעילות. דגרו את הלוחות המנומרים במהופך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים.צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד היום הרביעי ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן לשלושה מיליליטרים של SRD-URA ולדגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה למשך הלילה. למחרת, מדדו את הצפיפות האופטית של התאים שגודלו בתרבית במשך הלילה ב-600 ננומטר וחסנו את התאים ל-200 מיקרוליטרים של SD-URA ו-SG-URA טריים בלוחות של 96 בארות.התאם את הנפח הסופי הכולל את התאים ל-200 מיקרוליטרים והתאם את הצפיפות האופטית הראשונית של התא ל-0.05 ב-600 ננומטר. התאם את הגדרות התוכנית בצלחת המיקרוטיטר. הגדר את טמפרטורת היעד ל-30 מעלות צלזיוס, את זמן המרווח ל-15 דקות, את משך הטלטול ל-890 שניות, את משרעת הרעד ל-5 מילימטרים ואת המדידה כספיגה ב-600 ננומטר.דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות. נתח את הנתונים על ידי התוויית עקומת הצמיחה. לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מיליליטר של SRD-URA ולתרבת אותם בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה.למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית הלילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי לצפיפות אופטית של 0.003 ב-600 ננומטר, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה, עד שהצפיפות האופטית מגיעה ל-0.2. לאחר מכן להוסיף 300 microliters של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. לאסוף מיליליטר אחד של תרבית התא על ידי צנטריפוגה ב 800 גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.יש לתלות את כדור התא בעדינות ב-30 מיקרוליטרים של מים מזוקקים. הכינו כרית ג'ל אגרוז על מגלשת זכוכית. יש להשעות את התאים ולטעון חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים על מגלשת הזכוכית, ולכסות את התאים באמצעות כרית האגרוז החתוכה לבדיקה.כדי לבצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של 100x, השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת תמונות באמצעות התוכנית ובחר brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של 100x באמצעות שמן טבילה. עבור למסנן פלואורסצנטי GFP והתאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה ל-300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. פתח את קובץ התמונה ונתח את הנתונים על ידי ספירת התאים בהתבסס על מספר המוקדים בתאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.ביטוי הסינוקלאין תחת מקדם Gal1 בווקטור PRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי על לוחית האגר המכילה גלקטוז כמשרה. ההבדל בצמיחה על ידי ביטוי סינוקלאין נצפה גם בתרביות נוזליות. בשני תנאי התרבית, סינוקלאין מסוג בר וריאנטים עם מוטציות E46K או A53T הראו פגמי גדילה עקב רעילות סינוקלאין.עם זאת, גרסת הסינוקלאין A30p, שאינה יוצרת אגרגטים, הראתה פנוטיפ לא רעיל. הזנים שהפגינו ציטוטוקסיות חמורה הראו מוקדים של אגרגטים של סינוקלאין, אך בגרסת A30p התפזרה צורה פחות רעילה של סינוקלאין בכל התאים. כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב להשתמש בתא באותו שלב גדילה בכל ניסוי, במיוחד כאשר אתה עוקב אחר פנוטיפים הקשורים לסינוקלאין.כפי שהראינו בנתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי, סינוקלאין יכול ליצור אגרגטים גדולים יותר. לכן, ניתן פשוט לחלק אותו על ידי צנטריפוגה וניתן לכמת אותו על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי לסינוקלאין. טכניקה זו ישימה לבדיקת תפוקה גבוהה כדי למצוא גורמים גנטיים חדשים ותרכובות כימיות המשפיעות על צבירה של סינוקלאין.לפיכך, אנו מקווים למצוא מועמדים טיפוליים חדשים למחלת פרקינסון.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה<em&gt; סונקוס מורן</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...