Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
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Ringraziamo James Bardwell e Tiago F. Outeiro per aver gentilmente condiviso i plasmidi contenenti α-sinucleina. Changhan Lee ha ricevuto finanziamenti dalla National Research Foundation of Korea (NRF) finanziati dal governo coreano (MSIT) (sovvenzione 2021R1C1C1011690), dal Basic Science Research Program attraverso la NRF finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione (sovvenzione 2021R1A6A1A10044950) e dal nuovo fondo di ricerca della facoltà dell'Università di Ajou.

1. Preparazione di supporti e soluzioni
<ol><li>Preparazione dei supporti<ol><li>Per preparare il mezzo YPD, sciogliere 50 g di polvere YPD in dH2O per ottenere un volume finale di 1 L. Autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Per rendere YPD agar medio, sciogliere 50 g di polvere YPD e 20 g di agar in 1 L di dH2O. Autoclave per la sterilizzazione. Dopo aver raffreddato, versare sulle piastre di Petri. Conservare a 4 °C.</li>
		<li>Per ...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. 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F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. 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W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Data la complessità dei vari sistemi cellulari nell'uomo, è vantaggioso utilizzare il lievito come modello per lo studio delle malattie neurodegenerative umane. Sebbene sia quasi impossibile studiare le complesse interazioni cellulari del cervello umano usando il lievito, da una prospettiva monocellulare, le cellule di lievito hanno un alto livello di somiglianza con le cellule umane in termini di omologia della sequenza genomica e processi cellulari eucariotici fondamentali 8,13<sup ...

La malattia di Parkinson (PD) è un problema serio per le società che invecchiano in tutto il mondo. L'aggregazione della α-sinucleina è strettamente associata alla malattia di Parkinson e gli aggregati proteici della α-sinucleina sono ampiamente utilizzati come biomarcatore molecolare per diagnosticare la malattia1. α-sinucleina è una piccola proteina acida (140 amminoacidi di lunghezza) con tre domini, vale a dire la α-elica legante i lipidi N-terminale, il dominio centrale legante l'amiloide (NAC) e la coda acida C-terminale2. Il misfolding della α-sinucleina può verificarsi spontaneamente e alla fine porta alla formazione di aggregati amiloidi chiamati corpi di Lewy3. α-sinucleina può contribuire alla patogenesi della malattia di Parkinson in diversi modi. In generale, si pensa che le sue forme oligomeriche anormali e solubili chiamate protofibrille siano specie tossiche che causano la morte delle cellule neuronali colpendo vari bersagli cellulari, inclusa la funzione sinaptica3.
I modelli biologici utilizzati per studiare le malattie neurodegenerative devono essere rilevanti per l'uomo per quanto riguarda il loro genoma e la biologia cellulare. I migliori modelli sarebbero linee cellulari neuronali umane. Tuttavia, queste linee cellulari sono associate a diversi problemi tecnici, come difficoltà nel mantenimento delle colture, bassa efficienza della trasfezione e spese elevate4. Per questi motivi, è necessario uno strumento semplice e affidabile per accelerare i progressi in questo settore di ricerca. È importante sottolineare che lo strumento dovrebbe essere facile da usare per analizzare i dati raccolti. Da questi punti di vista, vari organismi modello sono stati ampiamente utilizzati, tra cui Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, lievito e roditori5. Tra questi, il lievito è il miglior organismo modello perché la manipolazione genetica è facile ed è più economico degli altri organismi modello. Ancora più importante, il lievito ha elevate somiglianze con le cellule umane, come il 60% di omologia di sequenza con ortologhi umani e il 25% di stretta omologia con geni correlati alla malattia umana6, e condividono anche la biologia cellulare eucariotica fondamentale. Il lievito contiene molte proteine con sequenze simili e funzioni analoghe a quelle delle cellule umane7. In effetti, il lievito che esprime geni umani è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per chiarire i processi cellulari8. Questo ceppo di lievito è chiamato lievito umanizzato ed è uno strumento utile per esplorare la funzione dei geni umani9. Il lievito umanizzato ha il merito di studiare le interazioni genetiche perché la manipolazione genetica è ben consolidata nel lievito.
In questo studio, abbiamo utilizzato il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello per studiare la patogenesi della malattia di Parkinson, in particolare per studiare la formazione di aggregati di α-sinucleina e la citotossicità10. Per l'espressione della α-sinucleina nel lievito in erba, il ceppo W303a è stato utilizzato per la trasformazione con plasmidi che codificano per le varianti wild-type e familiari associate al PD della α-sinucleina. Poiché il ceppo W303a ha una mutazione auxotrofica su URA3, è applicabile per la selezione di cellule contenenti plasmidi con URA3. L'espressione della α-sinucleina codificata in un plasmide è regolata dal promotore GAL1. Pertanto, il livello di espressione della α-sinucleina può essere controllato. Inoltre, la fusione della proteina fluorescente verde (GFP) nella regione C-terminale della α-sinucleina consente il monitoraggio della formazione di focolai di α-sinucleina. Per comprendere le caratteristiche delle varianti familiari associate alla PD della α-sinucleina, abbiamo anche espresso queste varianti nel lievito e esaminato i loro effetti cellulari. Questo sistema è uno strumento semplice per lo screening di composti o geni che mostrano ruoli protettivi contro la citotossicità della α-sinucleina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

La malattia di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più comune ed è caratterizzata da una progressiva morte cellulare causata dalla formazione di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina mal ripiegata e aggregata. α-sinucleina è un'abbondante proteina presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, ma l'accumulo delle sue inclusioni proteiche provoca neurotossicità. Studi recenti hanno rivelato che vari fattori genetici, tra cui gli chaperoni batterici, potrebbero ridurre la formazione di aggregati di α-sinucleina in vitro. Tuttavia, è anche importante monitorare l'effetto anti-aggregazione nella cellula per applicarlo come potenziale trattamento per i pazienti. Sarebbe ideale utilizzare cellule neuronali, ma queste cellule sono difficili da gestire e richiedono molto tempo per mostrare il fenotipo anti-aggregazione. Pertanto, è necessario uno strumento in vivo rapido ed efficace per l'ulteriore valutazione dell'attività antiaggregazione in vivo. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per monitorare e analizzare il fenotipo anti-aggregazione nel lievito umanizzato Saccharomyces cerevisiae, che esprimeva α-sinucleina umana. Questo protocollo dimostra strumenti in vivo che potrebbero essere utilizzati per monitorare la tossicità cellulare indotta da α-sinucleina, nonché la formazione di aggregati di α-sinucleina nelle cellule.

L'alta espressione di α-sinucleina è nota per essere collegata alla morte delle cellule neuronali e alla malattia di Parkinson in sistemi modello di PD. Questo studio descrive tre metodi per monitorare la citotossicità della α-sinucleina e la formazione di focolai di α-sinucleina aggregata nel lievito. Qui, la α-sinucleina è stata sovraespressa nel lievito e sono stati esaminati i fenotipi della α-sinucleina wild-type e tre varianti della α-sinucleina note come mutanti familiari della malattia di Parkinson (<str...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Questo è un metodo semplice per monitorare i fenotipi cellulari e le caratteristiche dei nuclei R-pass. Può anche essere spesso recuperato in studi sull'intero genoma per trovare i fattori genetici che influenzano la stabilità dei nuclei R-pass. Poiché si tratta di un organismo motorio ben consolidato, questa tecnica è facile e non richiede molto tempo e fatica rispetto all'utilizzo di linee cellulari umane o modelli animali.L'aggregazione dei nuclei R-pass è strettamente associata alla malattia di Parkinson. Le proteine o le sostanze chimiche che probabilmente influenzano la stabilità dei nuclei R-pass possono essere testate in questo modello di lievito umanizzato. Per iniziare, applicare tre singole colonie su una piastra di agar SD-URA per la selezione di cellule contenenti plasmidi alfa-sinucleina.Quindi, inoculare i trasformanti di lievito a tre patch per ceppo in 3 millilitri di SRD-URA per la crescita selettiva del lievito contenente i plasmidi con il 2% di raffinosio per l'inibizione dell'induzione di alfa-sinucleina sotto il promotore Gal1 e lo 0,1% di glucosio. Incubare la coltura inoculata a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Il giorno successivo, inoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 millilitri di SRD-URA fresco fino a raggiungere una densità ottica di 0,2 a 600 nanometri.Quindi, incubare la coltura per sei ore a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Misurare la densità ottica a 600 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente, diluire i campioni a una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri con acqua distillata sterile nella corsia 1 di una piastra a 96 pozzetti per equalizzare il numero di cellule in ciascuna coltura.Eseguire diluizioni seriali 5 volte delle cellule di lievito aggiungendo 160 microlitri di acqua distillata sterile alle cinque corsie successive e garantire un volume totale di 40 microlitri quando si diluiscono in serie le celle in ciascuna corsia. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri da ciascun pozzetto per individuare i campioni sulle piastre di agar SD-URA per i controlli e sulle piastre di agar SG-URA per monitorare la tossicità. Incubare le piastre maculate capovolte a 30 gradi Celsius per quattro giorni.Scatta immagini delle lastre ogni 24 ore fino al quarto giorno e poi analizza i dati confrontando le differenze di crescita tra i ceppi individuati ad occhio. Inoculare i tre trasformanti di lievito rattoppati per ceppo in tre millilitri di SRD-URA e incubare a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto durante la notte. Il giorno successivo, misurare la densità ottica delle cellule coltivate durante la notte a 600 nanometri e inoculare le cellule in un totale di 200 microlitri di SD-URA e SG-URA freschi in piastre da 96 pozzetti.Regolare il volume finale, comprese le celle, a 200 microlitri e regolare la densità ottica iniziale della cella a 0,05 a 600 nanometri. Regolare le impostazioni del programma nella piastra del microtitolo. Impostare la temperatura target a 30 gradi Celsius, il tempo di intervallo a 15 minuti, la durata dello scuotimento a 890 secondi, l'ampiezza di scuotimento a 5 millimetri e la misurazione come assorbanza a 600 nanometri.Incubare la piastra per 2-3 giorni affinché tutti i ceppi raggiungano la fase stazionaria in un lettore di micropiastre. Analizzare i dati tracciando la curva di crescita. Inoculare i trasformanti di lievito rattoppati in 3 millilitri di SRD-URA e coltivarli durante la notte a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto.Il giorno successivo, reinoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 millilitri di SRD-URA fresco a una densità ottica di 0,003 a 600 nanometri, quindi incubare la coltura a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto, fino a quando la densità ottica raggiunge 0,2. Quindi aggiungere 300 microlitri di galattosio al 20% e quindi incubare per altre 6 ore a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Raccogliere un millilitro di coltura cellulare mediante centrifugazione a 800 g per 5 minuti e scartare il surnatante.Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 30 microlitri di acqua distillata. Preparare un tampone di gel di agarosio su un vetrino. Risospendere le cellule e caricare cinque microlitri della risospensione cellulare sul vetrino e coprire le cellule usando il tampone di agarosio tagliato per l'esame.Per eseguire l'imaging microscopico con un obiettivo 100x, utilizzare l'opzione di acquisizione dello schermo per generare immagini utilizzando il programma e selezionare il campo luminoso per mettere a fuoco la cella con un obiettivo 100x utilizzando olio ad immersione. Passare a un filtro a fluorescenza GFP e regolare il tempo di esposizione dell'immagine tra 50 millisecondi e 300 millisecondi per ottenere un'immagine chiara bilanciando il rapporto segnale/rumore. Apri il file di immagine e analizza i dati contando le celle in base al numero di fuochi nelle celle utilizzando il software di analisi delle immagini.L'espressione della sinucleina sotto il promotore Gal1 nel vettore PRS426 ha mostrato un significativo ritardo della crescita sulla piastra di agar contenente galattosio come induttore. La differenza nella crescita per espressione della sinucleina è stata osservata anche nelle colture liquide. In entrambe le condizioni di coltura, la sinucleina wild-type e le varianti con mutazioni E46K o A53T hanno mostrato difetti di crescita dovuti alla tossicità della sinucleina.Tuttavia, la variante della sinucleina A30p, che non forma aggregati, ha mostrato un fenotipo non tossico. I ceppi che mostravano una grave citotossicità mostravano focolai di aggregati di sinucleina, ma nella variante A30p, una forma meno tossica di sinucleina era diffusa in tutte le cellule. Per ottenere risultati riproducibili, è importante utilizzare la cellula nella stessa fase di crescita in ogni esperimento, in particolare quando si monitorano i fenotipi associati alla sinucleina.Come abbiamo mostrato nei dati del microscopio fluorescente, la sinucleina può formare aggregati più grandi. Pertanto, può essere semplicemente frazionato mediante centrifugazione e può essere quantificato mediante western blotting utilizzando anticorpi specifici per la sinucleina. Questa tecnica è applicabile per lo screening ad alto rendimento per trovare nuovi fattori genetici e composti chimici che influenzano l'aggregazione della sinucleina.Quindi, speriamo di trovare nuovi candidati terapeutici per la malattia di Parkinson.

Research

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Biology

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