Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

α-シヌクレインを含むプラスミドを親切に共有してくれたJames BardwellとTiago F. Outeiroに感謝します。李長漢は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)から資金提供を受け(助成金2021R1C1C1011690)、教育省が資金提供するNRFによる基礎科学研究プログラム(助成金2021R1A6A1A10044950)、および亜洲大学の新しい教員研究基金を受け取りました。

1.培地と溶液の準備
<ol><li>メディアの準備<ol><li>YPD培地を調製するには、50 gのYPD粉末をdH2Oに溶解して、最終容量1 Lの滅菌用オートクレーブを作ります。室温(RT)で保管してください。</li>
		<li>YPD寒天培地を作るには、YPD粉末50gと寒天20gを1LのdH2O.オートクレーブに溶解して滅菌します。冷やした後、ペトリ皿に注ぎます。4°Cで保存してください。</li>
		<li>ラフィ?...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. 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A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

ヒトにおける様々な細胞系の複雑さを考えると、ヒトの神経変性疾患を研究するためのモデルとして酵母を使用することは有利である。酵母を用いてヒトの脳の複雑な細胞間相互作用を調べることはほぼ不可能ですが、単一細胞の観点からは、酵母細胞はゲノム配列の相同性および基本的な真核細胞プロセスの点でヒト細胞と高いレベルの類似性を持っています8,13<...

パーキンソン病(PD)は、世界中の高齢化社会にとって深刻な問題です。α-シヌクレインの凝集はPDと密接に関連しており、α-シヌクレインのタンパク質凝集体は疾患を診断するための分子バイオマーカーとして広く用いられている1。α-シヌクレインは、N末端脂質結合αヘリックス、アミロイド結合中心ドメイン(NAC)、C末端酸性テール2の3つのドメインを持つ小さな酸性タンパク質(長さ140アミノ酸)です。α-シヌクレインのミスフォールディングは自発的に起こり、最終的にはレビー小体3と呼ばれるアミロイド凝集体の形成につながります。α-シヌクレインは、いくつかの方法でPDの病因に寄与する可能性があります。一般に、プロトフィブリルと呼ばれるその異常で可溶性オリゴマー型は、シナプス機能を含むさまざまな細胞標的に影響を与えることによって神経細胞死を引き起こす有毒種であると考えられています3。
神経変性疾患の研究に使用される生物学的モデルは、そのゲノムおよび細胞生物学に関してヒトに関連している必要があります。最良のモデルはヒト神経細胞株でしょう。しかし、これらの細胞株は、培養の維持の難しさ、トランスフェクションの効率の低さ、高額な費用など、いくつかの技術的問題と関連しています4。これらの理由から、この研究分野の進歩を加速するには、簡単で信頼性の高いツールが必要です。重要なのは、収集されたデータの分析に使いやすいツールであることです。これらの観点から、 ショウジョウバエ、 カエノラブディティスエレガンス、 ダニオレリオ、酵母、げっ歯類など、さまざまなモデル生物が広く使用されています5。その中でも酵母は遺伝子操作が容易で、他のモデル生物よりも安価であるため、最良のモデル生物です。最も重要なことは、酵母はヒトオルソログと60%の配列相同性、ヒト疾患関連遺伝子と25%の密接な相同性など、ヒト細胞と高い類似性を持ち6、基本的な真核細胞生物学も共有していることです。酵母には、ヒト細胞と同様の配列と類似の機能を持つ多くのタンパク質が含まれています7。実際、ヒト遺伝子を発現する酵母は、細胞プロセスを解明するためのモデル系として広く用いられている8。この酵母株はヒト化酵母と呼ばれ、ヒト遺伝子の機能を探索するための有用なツールです9。ヒト化酵母は、遺伝子操作が酵母で十分に確立されているため、遺伝的相互作用を研究するためのメリットがあります。
本研究では、酵母サッカロマイセス・セレビシエをモデル生物としてPDの病態を研究し、特にα-シヌクレイン凝集体形成と細胞毒性を調べました10。出芽酵母におけるα-シヌクレインの発現のために、W303a株を、α-シヌクレインの野生型および家族性PD関連変異体をコードするプラスミドによる形質転換に使用した。W303a株はURA3に栄養要求性変異を有するため、URA3を有するプラスミドを含む細胞の選択に適用可能である。プラスミドにコードされるα-シヌクレインの発現は、GAL1プロモーターの下で調節されています。これにより、α-シヌクレインの発現量を制御することができる。さらに、α-シヌクレインのC末端領域における緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合により、α-シヌクレイン病巣形成のモニタリングが可能になります。α-シヌクレインの家族性PD関連変異体の特徴を理解するために、酵母でもこれらの変異体を発現させ、細胞効果を調べました。このシステムは、α-シヌクレインの細胞毒性に対する保護的役割を示す化合物または遺伝子をスクリーニングするための簡単なツールです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

パーキンソン病は2番目に多い神経変性疾患であり、誤って折りたたまれ凝集したα-シヌクレインを含むレビー小体の形成によって引き起こされる進行性の細胞死を特徴としています。α-シヌクレインは、シナプス小胞輸送を調節する豊富なシナプス前タンパク質ですが、そのタンパク質性封入体の蓄積は神経毒性をもたらします。最近の研究では、細菌のシャペロンを含むさまざまな遺伝的要因が、in vitroでのα-シヌクレイン凝集体の形成を減少させる可能性があることが明らかになりました。しかし、これを患者の潜在的な治療法として適用するために、細胞内の抗凝集効果を監視することも重要です。神経細胞を用いるのが理想的ですが、これらの細胞は取り扱いが難しく、抗凝集表現型を示すまでに長い時間がかかります。したがって、in vivo抗凝集活性のさらなる評価のために、迅速かつ効果的なin vivoツールが必要とされる。ここで説明した方法は、ヒトα-シヌクレインを発現するヒト化酵母サッカロミセス・セレビシエにおける抗凝集表現型をモニターおよび分析するために使用されました。このプロトコルは、α-シヌクレイン誘発性細胞毒性、および細胞内でのα-シヌクレイン凝集体の形成をモニタリングするために使用できるin vivoツールを実証します。

α-シヌクレインの高発現は、PDのモデル系における神経細胞死およびPDに関連していることが知られている。この研究では、酵母におけるα-シヌクレインの細胞毒性と凝集α-シヌクレインの病巣形成を監視する3つの方法について説明しています。ここでは、酵母でα-シヌクレインの過剰発現を行い、野生型α-シヌクレインの表現型とPDの家族性変異体として知られるα-シヌクレインの3つの変?...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo 生理学的モデルが必要です。ヒト化酵母モデルを用いてα-シヌクレインの細胞毒性と凝集体形成をモニターする方法を記載する。

ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

これは、Rパス核の細胞表現型と特徴を監視するための簡単な方法です。また、Rパス核の安定性に影響を与える遺伝的要因を見つけるために、ゲノムワイドな研究でしばしば回収することができます。これは十分に確立された運動生物であるため、この技術は簡単で、ヒト細胞株または動物モデルを使用する場合と比較して多くの時間と労力を必要としません。Rパス核の凝集はパーキンソン病と密接に関連しています。Rパス核の安定性に影響を与える可能性のあるタンパク質または化学物質は、このヒト化酵母モデルでテストできます。まず、3つのシングルコロニーをSD-URA寒天プレートにパッチして、α-シヌクレインプラスミドを含む細胞を選択します。次に、1株あたり3パッチした酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに接種し、プラスミドを含む酵母を選択的に増殖させ、Gal1プロモーター下でα-シヌクレインの誘導を阻害するための2%ラフィノースと0.1%グルコースを投与します。接種培養液を摂氏30度で、毎分200回転の撹拌下でインキュベートする。翌日、一晩培養した細胞を3ミリリットルの新鮮なSRD-URAに、600ナノメートルで0.2の光学密度に達するまで接種します。その後、培養液を摂氏30度で6時間インキュベートし、毎分200回転で撹拌する。分光光度計を用いて600ナノメートルの光学密度を測定する。次に、96ウェルプレートのレーン1で滅菌蒸留水でサンプルを600ナノメートルで光学密度0.5に希釈し、各培養の細胞数を均等にします。次の5つのレーンに160マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて酵母細胞の5倍段階希釈を実行し、各レーンで細胞を連続希釈するときに総容量40マイクロリットルを確保します。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10マイクロリットルを移し、コントロール用のSD-URA寒天プレートと毒性をモニタリングするためのSG-URA寒天プレート上のサンプルを見つけます。斑点を付けられたプレートを摂氏30度で逆さまに4日間インキュベートします。4日目まで24時間ごとにプレートの画像を撮り、目で見つけた株間の成長差を比較することによってデータを分析します。1株あたり3つのパッチを当てた酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに接種し、毎分200回転で攪拌しながら摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、600ナノメートルで一晩培養した細胞の光学密度を測定し、96ウェルプレートで合計200マイクロリットルの新鮮なSD-URAとSG-URAに細胞を接種します。セルを含む最終体積を200マイクロリットルに調整し、初期セル光学密度を600ナノメートルで0.05に調整します。マイクロタイタープレートのプログラム設定を調整します。目標温度を摂氏30度、間隔時間を15分、振とう時間を890秒、振とう振幅を5ミリメートルに設定し、600ナノメートルの吸光度として測定します。すべての菌株がマイクロプレートリーダーの固定相に到達するまで、プレートを2〜3日間インキュベートします。成長曲線をプロットしてデータを分析します。パッチを当てた酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに植菌し、毎分200回転の撹拌下で摂氏30度で一晩培養します。翌日、一晩培養した細胞を3ミリリットルの新鮮なSRD-URAに600ナノメートルで光学密度0.003に再接種し、光学密度が0.2に達するまで毎分200回転攪拌しながら摂氏30度で培養液をインキュベートします。次に、300マイクロリットルの20%ガラクトースを加え、毎分200回転で攪拌しながら摂氏30度でさらに6時間インキュベートします。800gで5分間遠心分離して1ミリリットルの細胞培養物を集め、上清を捨てる。セルペレットを30マイクロリットルの蒸留水に穏やかに再懸濁します。スライドガラス上にアガロースゲルパッドを準備します。細胞を再懸濁し、5マイクロリットルの細胞再懸濁液をスライドガラス上にロードし、検査のためにカットアガロースパッドを使用して細胞を覆います。100倍の対物レンズで顕微鏡イメージングを実行するには、プログラムを使用して画像を生成するためのスクリーンキャプチャオプションを使用し、明視野を選択して、液浸オイルを使用して100倍の対物レンズでセルに焦点を合わせます。GFP蛍光フィルターに切り替え、画像露光時間を50ミリ秒から300ミリ秒の間で調整して、信号対雑音比のバランスを取りながら鮮明な画像を実現します。画像ファイルを開き、画像解析ソフトウェアを使用して細胞内の病巣の数に基づいて細胞をカウントすることにより、データを解析します。PRS426ベクターのGal1プロモーター下でのシヌクレインの発現は、ガラクトースを誘導剤として含む寒天プレート上で有意な増殖遅延を示した。シヌクレインの発現による増殖の違いは、液体培養でも観察されました。いずれの培養条件においても、野生型シヌクレインおよびE46KまたはA53T変異を有する変異体は、シヌクレイン毒性による増殖障害を示した。しかしながら、凝集体を形成しないシヌクレインA30p変異体は、非毒性の表現型を示した。重篤な細胞毒性を示す株はシヌクレイン凝集体の病巣を示したが、A30p変異株では毒性の低い形態のシヌクレインは細胞全体に拡散した。再現性のある結果を得るには、特にシヌクレイン関連の表現型をモニタリングする場合は、各実験で同じ成長段階の細胞を使用することが重要です。蛍光顕微鏡データで示したように、シヌクレインはより大きな凝集体を形成する可能性があります。したがって、遠心分離によって簡単に分画することができ、シヌクレイン特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって定量することができる。この技術は、シヌクレインの凝集に影響を与える新規な遺伝的要因や化合物を見つけるためのハイスループットスクリーニングに適用できます。したがって、パーキンソン病の新しい治療薬候補を見つけることが期待されています。

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

生物学

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

成長アッセイ酵母におけるポリグルタミン毒性を評価する

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

「ヒト化」を生成<em&gt;ショウジョウバエ</emキネシン5の薬理学的阻害に感受性&gt; S2細胞株

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...