Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
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α-시누클레인을 함유한 플라스미드를 친절하게 공유해 주신 James Bardwell과 Tiago F. Outeiro에게 감사드립니다. 이창한은 한국 정부(MSIT)가 후원하는 한국연구재단(NRF)(보조금 2021R1C1C1C1011690), 교육부가 후원하는 NRF를 통한 기초과학 연구 프로그램(보조금 2021R1A6A1A10044950), 아주대학교 신임 교수 연구비로부터 자금을 지원받았다.

1. 매체 및 용액 준비
<ol><li>미디어 준비<ol><li>YPD 배지를 제조하기 위해, 50 g의 YPD 분말을dH2O에 용해시켜 1 L의 최종 부피를 만든다. 실온(RT)에서 보관하십시오.</li>
		<li>YPD 한천 배지를 만들려면 YPD 분말 50g과 한천 20g을 dH2O. 오토 클레이브 1L에 녹여 멸균하십시오. 식힌 후 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>라피노스 (SRd) -Ura 배지로 SC를 만들려면...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. 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F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

인간의 다양한 세포 시스템의 복잡성을 감안할 때, 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 모델로서 효모를 사용하는 것이 유리하다. 효모를 사용하여 인간 뇌의 복잡한 세포 상호 작용을 조사하는 것은 거의 불가능하지만, 단일 세포 관점에서 효모 세포는 게놈 서열 상 동성 및 근본적인 진핵 세포 과정 8,13 측면에서 인간 세포와 높은 수준의 유사성을...

파킨슨병(PD)은 전 세계적으로 고령화 사회에 심각한 문제입니다. α-시누클레인의 응집은 PD와 밀접한 관련이 있으며, α-시누클레인의 단백질 응집체는 질병진단을 위한 분자 바이오마커로 널리 사용됩니다1. α- synuclein은 3 개의 도메인, 즉 N 말단 지질 결합 α- 나선, 아밀로이드 결합 중심 도메인 (NAC) 및 C- 말단 산성 꼬리2를 갖는 작은 산성 단백질 (길이 140 아미노산)이다. α-synuclein의 잘못 접힘은 자발적으로 발생할 수 있으며 결국 Lewybody3라고하는 아밀로이드 응집체의 형성으로 이어집니다. α-시누클레인은 여러 면에서 PD의 발병기전에 기여할 수 있다. 일반적으로, 프로토피브릴이라고 하는 그의 비정상적이고 용해성 올리고머 형태는 시냅스 기능3을 포함한 다양한 세포 표적에 영향을 주어 신경 세포 사멸을 유발하는 독성 종으로 생각된다.
신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 생물학적 모델은 게놈 및 세포 생물학과 관련하여 인간과 관련이 있어야합니다. 가장 좋은 모델은 인간 신경 세포주입니다. 그러나, 이들 세포주는 배양물의 유지의 어려움, 형질감염의 낮은 효율, 및 높은 비용4과 같은 몇몇 기술적 문제와 연관된다. 이러한 이유로이 연구 분야의 진행을 가속화하려면 쉽고 신뢰할 수있는 도구가 필요합니다. 중요한 것은 이 도구가 수집된 데이터를 분석하는 데 사용하기 쉬워야 한다는 것입니다. 이러한 관점에서, 초파리, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, 효모 및 설치류5를 포함한 다양한 모델 유기체가 널리 사용되었습니다. 그 중에서도 효모는 유전자 조작이 쉽고 다른 모델 유기체보다 저렴하기 때문에 최고의 모델 유기체입니다. 가장 중요한 것은 효모가 인간 ortholog에 대한 60% 서열 상동성 및 인간 질병 관련 유전자6와 25% 밀접한 상동성과 같이 인간 세포와 높은 유사성을 가지며 근본적인 진핵 세포 생물학도 공유한다는 것입니다. 효모는 인간 세포와 유사한 서열 및 유사한 기능을 가진 많은 단백질을 함유하고 있습니다7. 실제로, 인간 유전자를 발현하는 효모는세포 과정을 해명하기 위한 모델 시스템으로서 널리 사용되어 왔다8. 이 효모 균주는 인간화 효모라고 불리며 인간 유전자의 기능을 탐구하는 데 유용한 도구입니다9. 인간화 효모는 유전자 조작이 효모에서 잘 확립되어 있기 때문에 유전적 상호 작용을 연구하는 데 장점이 있습니다.
이 연구에서는 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 PD의 발병 기전을 연구하기위한 모델 유기체로 사용했으며, 특히 α- 시누 클레인 응집체 형성 및 세포 독성을 조사했습니다10. 출아 효모에서 α-시누클레인의 발현을 위해, W303a 균주를 α-시누클레인의 야생형 및 가족성 PD-관련 변이체를 암호화하는 플라스미드로 형질전환에 사용하였다. W303a 균주는 URA3에 영양요구성 돌연변이가 있기 때문에 URA3가 있는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택에 적용할 수 있습니다. 플라스미드에서 암호화된 α-시누클레인의 발현은 GAL1 프로모터 하에서 조절된다. 따라서, α-시누클레인의 발현 수준을 조절할 수 있다. 또한, α- 시누 클레인의 C- 말단 영역에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 융합은 α- 시누 클레인 초점 형성의 모니터링을 가능하게한다. α-synuclein의 가족성 PD 관련 변이체의 특성을 이해하기 위해, 우리는 또한 효모에서 이러한 변이체를 발현하고 그들의 세포 효과를 조사하였다. 이 시스템은 α-시누클레인의 세포독성에 대한 보호 역할을 나타내는 화합물 또는 유전자를 스크리닝하기 위한 간단한 도구입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

파킨슨 병은 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이며 잘못 접히고 응집 된 α- 시누 클레인을 포함하는 Lewy 체의 형성으로 인한 진행성 세포 사멸을 특징으로합니다. α-시누클레인은 시냅스 소포 트래피킹을 조절하는 풍부한 시냅스 전 단백질이지만 단백질성 개재물의 축적은 신경독성을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 박테리아 샤페론을 포함한 다양한 유전적 요인이 시험관 내에서 α-시누클레인 응집체의 형성을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나, 이를 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 적용하기 위해 세포에서 항응집 효과를 모니터링하는 것도 중요하다. 신경 세포를 사용하는 것이 이상적이지만 이러한 세포는 다루기가 어렵고 응집 방지 표현형을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다. 따라서, 생체내 항응집 활성의 추가 평가를 위해 신속하고 효과적인 생체내 도구가 필요하다. 여기에 설명된 방법은 인간 α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 항응집 표현형을 모니터링하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 α-시누클레인 유도 세포 독성과 세포에서 α-시누클레인 응집체 형성을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생체 내 도구를 보여줍니다.

α-시누클레인의 높은 발현은 PD의 모델 시스템에서 신경 세포 사멸 및 PD와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 연구는 α- 시누 클레인의 세포 독성과 효모에서 응집 된 α- 시누 클레인의 초점 형성을 모니터링하는 세 가지 방법을 설명합니다. 여기에서는 효모에서 α-시누클레인이 과발현되었고, 야생형 α-시누클레인의 표현형과 PD의 가족성 돌연변이체로 알려진 α-시누클레인의 3가지 변이?...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

이것은 R-pass 핵의 세포 표현형과 특징을 모니터링하는 간단한 방법입니다. 또한 R-pass 핵의 안정성에 영향을 미치는 유전적 요인을 찾기 위해 게놈 전체 연구에서 종종 회수될 수 있습니다. 이것은 잘 확립 된 운동 유기체이기 때문에이 기술은 쉽고 인간 세포주 또는 동물 모델을 사용하는 것에 비해 많은 시간과 노력이 필요하지 않습니다.R- 패스 핵의 응집은 파킨슨 병과 밀접한 관련이 있습니다. R-pass 핵의 안정성에 영향을 미칠 가능성이 있는 단백질 또는 화학 물질은 이 인간화 효모 모델에서 테스트할 수 있습니다. 시작하려면 알파-시누클레인 플라스미드를 포함하는 세포를 선택하기 위해 SD-URA 한천 플레이트에 3개의 단일 콜로니를 패치합니다.이어서, 3-패치된 효모 형질전환체를 3 밀리리터의 SRD-URA에 접종하여 플라스미드를 함유하는 효모의 선택적 성장을 위해 Gal1 프로모터 및 0.1% 글루코스 하에서 알파-시누클레인의 유도를 억제하기 위한 2% 라피노스로 플라스미드를 함유한다. 접종된 배양물을 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양한다. 다음날, 밤새 배양 된 세포를 600 나노 미터에서 0.2의 광학 밀도에 도달 할 때까지 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 접종합니다.이어서, 배양물을 분당 200 회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 6시간 동안 배양한다. 분광 광도계를 사용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 샘플을 96-웰 플레이트의 레인 1에 멸균 증류수로 600 나노미터에서 0.5의 광학 밀도로 희석하여 각 배양물에서 세포의 수를 균등화한다.다음 5개 레인에 160마이크로리터의 멸균 증류수를 추가하여 효모 세포의 5배 연속 희석을 수행하고 각 레인에서 세포를 연속 희석할 때 총 부피가 40마이크로리터가 되도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10마이크로리터를 옮겨 대조군용 SD-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하고 SG-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하여 독성을 모니터링합니다. 발견 된 판을 섭씨 30도에서 거꾸로 4 일 동안 배양하십시오.4일째까지 24시간마다 플레이트의 이미지를 촬영한 다음 눈으로 발견한 균주 간의 성장 차이를 비교하여 데이터를 분석합니다. 균주당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 밤새 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음날, 600 나노미터에서 밤새 배양한 세포의 광학 밀도를 측정하고 세포를 총 200 마이크로리터의 신선한 SD-URA와 SG-URA를 96-웰 플레이트에 접종하였다.세포를 포함하는 최종 부피를 200 마이크로리터로 조정하고, 초기 세포 광학 밀도를 600 나노미터에서 0.05로 조정한다. 마이크로타이터 플레이트에서 프로그램 설정을 조정합니다. 목표 온도를 섭씨 30도, 간격 시간을 15분, 진동 지속 시간을 890초, 진동 진폭을 5mm로 설정하고 600나노미터에서 흡광도로 측정합니다.모든 균주가 마이크로플레이트 리더에서 고정상에 도달하기 위해 플레이트를 2-3일 동안 배양합니다. 성장 곡선을 플로팅하여 데이터를 분석합니다. 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.다음날, 밤새 배양 된 세포를 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 600 나노 미터에서 0.003의 광학 밀도로 재 접종 한 다음 광학 밀도가 0.2에 도달 할 때까지 분당 200 회전으로 교반하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 20 % 갈락토스를 추가 한 다음 분당 200 회전으로 교반 하에서 섭씨 30도에서 6 시간 더 배양합니다. 800g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 배양액 1 밀리리터를 수집하고 상청액을 버린다.30마이크로리터의 증류수에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 유리 슬라이드에 아가 로스 겔 패드를 준비하십시오. 세포를 재현탁시키고, 5 마이크로리터의 세포 재현탁액을 유리 슬라이드 상에 로딩하고, 절단된 아가로스 패드를 사용하여 세포를 검사용으로 덮는다.100x 대물렌즈로 현미경 이미징을 수행하려면 프로그램을 사용하여 이미지를 생성하는 화면 캡처 옵션을 사용하고 명시야를 선택하여 이멀젼 오일을 사용하여 100x 대물렌즈로 셀의 초점을 맞춥니다. GFP 형광 필터로 전환하고 이미지 노출 시간을 50밀리초에서 300밀리초 사이로 조정하여 신호 대 노이즈 비율의 균형을 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 이미지 파일을 열고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포의 초점 수를 기준으로 세포를 계수하여 데이터를 분석합니다.PRS426 벡터에서 Gal1 프로모터 하의 시누클레인 발현은 유도제로서 갈락토오스를 함유하는 한천 플레이트에서 현저한 성장 지연을 보였다. 시누클레인 발현에 의한 성장의 차이는 또한 액체 배양물에서 관찰되었다. 두 배양 조건 모두에서 야생형 시누클레인 및 E46K 또는 A53T 돌연변이가 있는 변이체는 시누클레인 독성으로 인한 성장 결함을 보였다.그러나, 응집체를 형성하지 않는 synuclein A30p 변이체는 무독성 표현형을 보였다. 심각한 세포 독성을 나타내는 균주는 시누 클레인 응집체의 초점을 보였지만 A30p 변종에서는 독성이 적은 형태의 시누 클레인이 세포 전체에 확산되었습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 특히 시누클레인 관련 표현형을 모니터링할 때 각 실험에서 동일한 성장 단계의 세포를 사용하는 것이 중요합니다.형광 현미경 데이터에서 볼 수 있듯이 synuclein은 더 큰 응집체를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 원심분리에 의해 간단히 분획될 수 있고, 시누클레인-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 정량화될 수 있다. 이 기술은 synuclein의 응집에 영향을 미치는 새로운 유전 인자 및 화합물을 찾기 위한 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.따라서 우리는 파킨슨 병에 대한 새로운 치료 후보를 찾기를 희망합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

연구

생물학

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

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&quot;인간 답게&quot;를 생성<em&gt; 초파리</em키네신-5의 약리 억제에&gt; S2 세포주 민감성

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

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담관의 보행을 연구하기위한 Whole-mount Immunohistochemical method의 사용<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...