Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

Vi takker James Bardwell og Tiago F. Outeiro for vennlig deling av plasmider som inneholder α-synuclein. Changhan Lee mottok finansiering fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (stipend 2021R1C1C1011690), Basic Science Research Program gjennom NRF finansiert av Utdanningsdepartementet (stipend 2021R1A6A1A10044950), og det nye fakultetets forskningsfond ved Ajou University.

1. Utarbeidelse av medier og løsninger
<ol><li>Forberedelse av media<ol><li>For å forberede YPROD-medium, oppløs 50 g YPOD-pulver i dH2O for å lage et endelig volum på 1 L. Autoklav for sterilisering. Oppbevares ved romtemperatur (RT).</li>
		<li>For å lage YPD agar medium, oppløs 50 g YPD pulver og 20 g agar i 1 L dH2O. Autoklav for sterilisering. Etter avkjøling, hell på petriskåler. Oppbevares ved 4 °C.</li>
		<li>For å lage SC med raffinose (SRd)-Ura medium, opplø...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Gitt kompleksiteten til ulike cellulære systemer hos mennesker, er det fordelaktig å bruke gjær som en modell for å studere humane neurodegenerative sykdommer. Selv om det er nesten umulig å undersøke de komplekse cellulære interaksjonene til den menneskelige hjernen ved hjelp av gjær, har gjærceller fra et encellet perspektiv et høyt nivå av likhet med humane celler når det gjelder genomisk sekvens homologi og grunnleggende eukaryote cellulære prosesser 8,13<sup class="xre...

Parkinsons sykdom (PD) er et alvorlig problem for aldrende samfunn over hele verden. Aggregering av α-synuclein er nært forbundet med PD, og proteinaggregater av α-synuclein er mye brukt som en molekylær biomarkør for diagnostiseringav sykdommen. α-synuclein er et lite surt protein (140 aminosyrer i lengde) med tre domener, nemlig den N-terminale lipidbindende α-helixen, det amyloidbindende sentrale domenet (NAC) og den C-terminale sure halen2. Feilfoldingen av α-synuclein kan oppstå spontant og til slutt fører til dannelsen av amyloidaggregater kalt Lewy-legemer3. α-synuclein kan bidra til patogenesen av PD på flere måter. Generelt antas det at dets unormale, oppløselige oligomere former kalt protofibriller er giftige arter som forårsaker nevroncelledød ved å påvirke ulike cellulære mål, inkludert synaptisk funksjon3.
De biologiske modellene som brukes til å studere nevrodegenerative sykdommer må være relevante for mennesker med hensyn til deres genom- og cellebiologi. De beste modellene ville være menneskelige nevroncellelinjer. Imidlertid er disse cellelinjene forbundet med flere tekniske problemer, for eksempel vanskeligheter med vedlikehold av kulturer, lav effektivitet av transfeksjon og høye kostnader4. Av disse grunner er det nødvendig med et enkelt og pålitelig verktøy for å akselerere fremdriften på dette forskningsområdet. Det er viktig at verktøyet skal være enkelt å bruke for å analysere de innsamlede dataene. Fra disse perspektivene har ulike modellorganismer blitt mye brukt, inkludert Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gjær og gnagere5. Blant dem er gjær den beste modellorganismen fordi genetisk manipulasjon er lett, og det er billigere enn de andre modellorganismene. Viktigst av alt har gjær høye likheter med humane celler, for eksempel 60% sekvens homologi til humane ortologer og 25% nær homologi med humane sykdomsrelaterte gener6, og de deler også grunnleggende eukaryotisk cellebiologi. Gjær inneholder mange proteiner med lignende sekvenser og analoge funksjoner som de i humane celler7. Faktisk har gjær som uttrykker menneskelige gener blitt mye brukt som et modellsystem for å belyse cellulære prosesser8. Denne gjærstammen kalles humanisert gjær og er et nyttig verktøy for å utforske funksjonen til menneskelige gener9. Humanisert gjær har fortjeneste for å studere genetiske interaksjoner fordi genetisk manipulasjon er godt etablert i gjær.
I denne studien brukte vi gjær Saccharomyces cerevisiae som en modellorganisme for å studere patogenesen til PD, spesielt for å undersøke α-synuclein-aggregatdannelse og cytotoksisitet10. For uttrykket av α-synuclein i den spirende gjæren ble W303a-stammen brukt til transformasjon med plasmider som koder for villtype og familiære PD-assosierte varianter av α-synuclein. Siden W303a-stammen har en auxotrofisk mutasjon på URA3, er den anvendelig for valg av celler som inneholder plasmider med URA3. Uttrykket av α-synuclein kodet i et plasmid er regulert under GAL1-promotoren. Dermed kan ekspresjonsnivået av α-synuclein kontrolleres. I tillegg tillater fusjonen av grønt fluorescerende protein (GFP) ved den C-terminale regionen av α-synuclein overvåking av α-synuclein foci formasjon. For å forstå egenskapene til de familiære PD-assosierte varianter av α-synuclein, uttrykte vi også disse varianter i gjær og undersøkte deres cellulære effekter. Dette systemet er et enkelt verktøy for screening av forbindelser eller gener som viser beskyttende roller mot cytotoksisiteten til α-synuclein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

Parkinsons sykdom er den nest vanligste nevrodegenerative lidelsen og er preget av progressiv celledød forårsaket av dannelsen av Lewy-legemer som inneholder feilfoldet og aggregert α-synuclein. α-synuclein er et rikelig presynaptisk protein som regulerer synaptisk vesikkelhandel, men akkumuleringen av proteinholdige inneslutninger resulterer i nevrotoksisitet. Nylige studier har vist at ulike genetiske faktorer, inkludert bakterielle chaperones, kan redusere dannelsen av α-synuclein-aggregater in vitro. Det er imidlertid også viktig å overvåke antiaggregeringseffekten i cellen for å anvende dette som en potensiell behandling for pasientene. Det ville være ideelt å bruke nevronceller, men disse cellene er vanskelige å håndtere og tar lang tid å utvise antiaggregeringsfenotypen. Derfor er det nødvendig med et raskt og effektivt in vivo-verktøy for videre evaluering av in vivo antiaggregeringsaktivitet. Metoden beskrevet her ble brukt til å overvåke og analysere antiaggregeringsfenotypen i den humaniserte gjæren Saccharomyces cerevisiae, som uttrykte humant α-synuclein. Denne protokollen demonstrerer in vivo verktøy som kan brukes til å overvåke α-synuclein-indusert cellulær toksisitet, samt dannelsen av α-synuclein-aggregater i celler.

Det høye uttrykket av α-synuclein er kjent for å være knyttet til nevroncelledød og PD i modellsystemer av PD. Denne studien beskriver tre metoder for å overvåke cytotoksisiteten av α-synuclein og foci-dannelsen av aggregert α-synuclein i gjær. Her ble α-synuclein overuttrykt i gjær, og fenotypene av villtype α-synuclein og tre varianter av α-synuclein kjent som familiære mutanter av PD ble undersøkt (figur 1 og materialtabellen).
...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

En in vivo fysiologisk modell av α-synuclein er nødvendig for å studere og forstå patogenesen av Parkinsons sykdom. Vi beskriver en metode for å overvåke cytotoksisitet og aggregert dannelse av α-synuclein ved hjelp av en humanisert gjærmodell.

En metode for å studere α-synuclein toksisitet og aggregering ved hjelp av en humanisert gjærmodell

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Dette er en enkel metode for å overvåke cellulære fenotyper og egenskaper av R-passkjerner. Det kan også ofte gjenopprettes i genom-bred studie for å finne de genetiske faktorene som påvirker stabiliteten til R-passkjerner. Siden dette er en veletablert motororganisme, er denne teknikken enkel og krever ikke mye tid og krefter sammenlignet med bruk av menneskelige cellelinjer eller dyremodeller.Aggregering av R-pass kjerner er nært forbundet med Parkinsons sykdom. Proteiner eller kjemikalier som sannsynligvis påvirker stabiliteten til R-pass kjerner kan testes i denne humaniserte gjærmodellen. For å begynne, tre enkeltkolonier på en SD-URA agarplate for valg av celler som inneholder alfa-synuclein plasmider.Deretter inokulerer de tre-lappede gjærtransformantene per stamme til 3 milliliter SRD-URA for selektiv vekst av gjær som inneholder plasmidene med 2% raffinose for inhibering av induksjonen av alfa-synuclein under Gal1-promotoren og 0,1% glukose. Inkuber den inokulerte kulturen ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt. Neste dag inokulerer de nattlige dyrkede cellene til 3 milliliter fersk SRD-URA til de når en optisk tetthet på 0, 2 ved 600 nanometer.Deretter inkuberer kulturen i seks timer ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt. Mål den optiske tettheten ved 600 nanometer ved hjelp av et spektrofotometer. Deretter fortynner prøvene til en optisk tetthet på 0, 5 ved 600 nanometer med sterilt destillert vann i bane 1 av en 96-brønnplate for å utjevne antall celler i hver kultur.Utfør 5 ganger serielle fortynninger av gjærcellene ved å tilsette 160 mikroliter sterilt destillert vann til de neste fem banene og sikre et totalt volum på 40 mikroliter når du serielt fortynner cellene i hver bane. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 10 mikroliter fra hver brønn for å oppdage prøvene på SD-URA agarplater for kontrollene og SG-URA agarplater for å overvåke toksisitet. Inkuber flekkplatene opp ned ved 30 grader celsius i fire dager.Ta bilder av platene hver 24. time til dag fire, og analyser deretter dataene ved å sammenligne vekstforskjellene mellom stammer oppdaget av øyet. Inokulere de tre lappede gjærtransformantene per belastning til tre milliliter SRD-URA og inkubere ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt over natten. Neste dag måler du den optiske tettheten til cellene dyrket over natten på 600 nanometer og inokulerer cellene til totalt 200 mikroliter fersk SD-URA og SG-URA i 96-brønnplater.Juster det endelige volumet inkludert cellene til 200 mikroliter og juster den første optiske tettheten til 0,05 ved 600 nanometer. Juster programinnstillingene i mikrotiterplaten. Sett måltemperaturen til 30 grader celsius, intervalltiden til 15 minutter, ristingsvarigheten til 890 sekunder, risteamplituden til 5 millimeter og målingen som absorbans ved 600 nanometer.Inkuber platen i 2-3 dager for at alle stammene skal nå den stasjonære fasen i en mikroplateleser. Analyser dataene ved å plotte vekstkurven. Inokulere de lappede gjærtransformantene til 3 milliliter SRD-URA og dyrk dem over natten ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt.Neste dag, re-inokulere natten dyrkede celler i 3 milliliter frisk SRD-URA til en optisk tetthet på 0,003 ved 600 nanometer, deretter inkubere kulturen ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt, til den optiske tettheten når 0,2. Tilsett deretter 300 mikroliter 20% galaktose, og inkuber deretter i ytterligere 6 timer ved 30 grader celsius under agitasjon ved 200 rotasjoner per minutt. Samle en milliliter av cellekulturen ved sentrifugering ved 800 g i 5 minutter og kast supernatanten.Resuspend cellepelleten forsiktig i 30 mikroliter destillert vann. Forbered en agarosegelpute på et glassglass. Resuspend cellene og legg fem mikroliter av celleresuspenderingen på glassglasset, og dekk cellene ved hjelp av den kuttede agaroseputen for undersøkelse.For å utføre mikroskopisk bildebehandling med et 100x mål, bruk skjermopptaksalternativet for å generere bilder ved hjelp av programmet og velg brightfield for å fokusere cellen med et 100x mål ved hjelp av nedsenkingsolje. Bytt til et GFP-fluorescensfilter og juster bildeeksponeringstiden til mellom 50 millisekund og 300 millisekund for å oppnå et klart bilde ved å balansere signal-til-støy-forholdet. Åpne bildefilen og analyser dataene ved å telle cellene basert på antall foci i cellene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.Synucleinuttrykket under Gal1-promotoren i PRS426-vektoren viste signifikant vekstretardasjon på agarplaten som inneholdt galaktose som en induktor. Forskjellen i vekst ved synucleinuttrykk ble også observert i flytende kulturer. Under begge kulturforhold viste villtype synuclein og varianter med E46K- eller A53T-mutasjoner vekstdefekter på grunn av synucleintoksisitet.Synuclein A30p-varianten, som ikke danner aggregater, viste imidlertid en giftfri fenotype. Stammene som viste alvorlig cytotoksisitet viste fokus på synucleinaggregater, men i A30p-varianten ble en mindre giftig form for synuclein diffust gjennom cellene. For å oppnå reproduserbare resultater er det viktig å bruke cellen i samme vekststadium i hvert eksperiment, spesielt når du overvåker synucleinassosierte fenotyper.Som vi har vist i fluorescerende mikroskopdata, kan synuclein danne større aggregater. Derfor kan det ganske enkelt fraksjoneres ved sentrifugering og kan kvantifiseres ved vestlig blotting ved bruk av synuclein-spesifikt antistoff. Denne teknikken er anvendelig for høy gjennomstrømningsscreening for å finne nye genetiske faktorer og kjemiske forbindelser som påvirker aggregering av synuclein.Dermed håper vi å finne nye terapeutiske kandidater for Parkinsons sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Vekst Analyser å vurdere Polyglutamine giftighet i Gjær

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Genererer en &quot;humanisert&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellelinje Sensitive til Farmakologisk Hemming av kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Bruke en helmontert immunhistokjemisk metode for å studere innerveringen av galdevegen i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for Testing toksisitet av romanen Insecticidal kjemikalier til mygg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...