Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
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Agradecemos a James Bardwell e Tiago F. Outeiro por terem gentilmente partilhado os plasmídeos contendo α-sinucleína. Changhan Lee recebeu financiamento da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (subsídio 2021R1C1C1011690), o Programa de Pesquisa em Ciência Básica através do NRF financiado pelo Ministério da Educação (subsídio 2021R1A6A1A10044950) e o novo fundo de pesquisa do corpo docente da Universidade de Ajo.

1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Preparação para a mídia<ol><li>Para preparar o meio YPD, dissolver 50 g de pó de YPD em dH2O para fazer um volume final de 1 L. Autoclave para esterilização. Armazenar à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Para fazer meio de ágar YPD, dissolver 50 g de pó de YPD e 20 g de ágar em 1 L de dH2O. Autoclave para esterilização. Depois de esfriar, despeje em placas de Petri. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Para fazer SC com meio d...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Dada a complexidade de vários sistemas celulares em humanos, é vantajoso usar levedura como modelo para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Embora seja quase impossível investigar as complexas interações celulares do cérebro humano usando leveduras, a partir de uma perspectiva unicelular, as células de levedura têm um alto nível de semelhança com as células humanas em termos de homologia da sequência genômica e processos celulares eucarióticos fundamentais 8,13<su...

A doença de Parkinson (DP) é um problema sério para as sociedades em envelhecimento em todo o mundo. A agregação de α-sinucleína está intimamente associada à DP, e agregados proteicos de α-sinucleína são amplamente utilizados como biomarcador molecular para o diagnóstico da doença1. α-sinucleína é uma pequena proteína ácida (140 aminoácidos de comprimento) com três domínios, a saber, a α-hélice de ligação lipídica N-terminal, o domínio central de ligação a amiloide (NAC) e a cauda ácida C-terminal2. O desdobramento da α-sinucleína pode ocorrer espontaneamente e, eventualmente, leva à formação de agregados amiloides chamados corpos de Lewy3. α-sinucleína pode contribuir para a patogênese da DP de várias maneiras. Em geral, pensa-se que suas formas oligoméricas anormais e solúveis chamadas protofibrilas são espécies tóxicas que causam a morte celular neuronal por afetar vários alvos celulares, incluindo a função sináptica3.
Os modelos biológicos utilizados para estudar doenças neurodegenerativas devem ser relevantes para os seres humanos no que diz respeito ao seu genoma e biologia celular. Os melhores modelos seriam linhagens celulares neuronais humanas. No entanto, essas linhagens celulares estão associadas a diversas questões técnicas, como dificuldades na manutenção das culturas, baixa eficiência da transfecção e alto gasto4. Por estas razões, é necessária uma ferramenta fácil e fiável para acelerar o progresso nesta área de investigação. É importante ressaltar que a ferramenta deve ser fácil de usar para analisar os dados coletados. A partir dessas perspectivas, vários organismos modelo têm sido amplamente utilizados, incluindo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, leveduras e roedores5. Entre eles, a levedura é o melhor organismo modelo porque a manipulação genética é fácil e é mais barata do que os outros organismos modelo. Mais importante ainda, a levedura tem altas semelhanças com as células humanas, como 60% de homologia de sequência para ortólogos humanos e 25% de homologia próxima com genes relacionados a doenças humanas6, e eles também compartilham biologia celular eucariótica fundamental. A levedura contém muitas proteínas com sequências semelhantes e funções análogas às das células humanas7. De fato, leveduras que expressam genes humanos têm sido amplamente utilizadas como um sistema modelo para elucidar processos celulares8. Essa cepa de levedura é chamada de levedura humanizada e é uma ferramenta útil para explorar a função dos genes humanos9. A levedura humanizada tem mérito para estudar as interações genéticas porque a manipulação genética está bem estabelecida na levedura.
Neste estudo, utilizamos a levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudar a patogênese da DP, particularmente para investigar a formação de agregados de α-sinucleína e citotoxicidade10. Para a expressão de α-sinucleína na levedura em brotamento, a cepa W303a foi utilizada para transformação com plasmídeos codificando para as variantes de α-sinucleína associadas à DP selvagem e familiar. Como a cepa W303a tem uma mutação auxotrófica na URA3, ela é aplicável para a seleção de células contendo plasmídeos com URA3. A expressão de α-sinucleína codificada em um plasmídeo é regulada pelo promotor GAL1. Assim, o nível de expressão da α-sinucleína pode ser controlado. Além disso, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) na região C-terminal da α-sinucleína permite o monitoramento da formação de focos de α-sinucleína. Para entender as características das variantes familiares associadas à DP da α-sinucleína, também expressamos essas variantes em leveduras e examinamos seus efeitos celulares. Este sistema é uma ferramenta simples para a triagem de compostos ou genes que exibem papéis protetores contra a citotoxicidade da α-sinucleína.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

A doença de Parkinson é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais comum e é caracterizada pela morte celular progressiva causada pela formação de corpos de Lewy contendo α-sinucleína mal dobrada e agregada. α-sinucleína é uma proteína pré-sináptica abundante que regula o tráfico de vesículas sinápticas, mas o acúmulo de suas inclusões proteicas resulta em neurotoxicidade. Estudos recentes revelaram que vários fatores genéticos, incluindo chaperonas bacterianas, poderiam reduzir a formação de agregados de α-sinucleína in vitro. No entanto, também é importante monitorar o efeito anti-agregação na célula para aplicá-lo como um tratamento potencial para os pacientes. Seria ideal usar células neuronais, mas essas células são difíceis de manusear e levam muito tempo para exibir o fenótipo anti-agregação. Portanto, uma ferramenta in vivo rápida e eficaz é necessária para a avaliação adicional da atividade antiagregação in vivo. O método aqui descrito foi utilizado para monitorar e analisar o fenótipo antiagregação na levedura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expressou α-sinucleína humana. Este protocolo demonstra ferramentas in vivo que poderiam ser usadas para monitorar a toxicidade celular induzida por α-sinucleína, bem como a formação de agregados de α-sinucleína nas células.

A alta expressão de α-sinucleína é conhecida por estar ligada à morte celular neuronal e à DP em sistemas modelo de DP. Este estudo descreve três métodos para monitorar a citotoxicidade da α-sinucleína e a formação de focos de α-sinucleína agregada em leveduras. Aqui, a α-sinucleína foi superexpressa em levedura, e os fenótipos de sinucleína α selvagem e três variantes de α-sinucleína conhecidas como mutantes familiares da DP foram examinados (Figura 1 e Tabela ...

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A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Este é um método simples para monitorar fenótipos celulares e características dos núcleos R-pass. Também pode ser frequentemente recuperado em um estudo de todo o genoma para encontrar os fatores genéticos que afetam a estabilidade dos núcleos R-pass. Uma vez que este é um organismo motor bem estabelecido, esta técnica é fácil e não requer muito tempo e esforço em comparação com o uso de linhagens celulares humanas ou modelos animais.A agregação de núcleos R-pass está intimamente associada à doença de Parkinson. As proteínas ou produtos químicos que provavelmente afetam a estabilidade dos núcleos R-pass podem ser testados neste modelo de levedura humanizada. Para começar, coloque três colônias únicas em uma placa de ágar SD-URA para a seleção de células contendo plasmídeos de alfa-sinucleína.Em seguida, inocular os transformadores de levedura de três remendas por cepa em 3 mililitros de SRD-URA para o crescimento seletivo de leveduras contendo os plasmídeos com 2% de rafinose para inibição da indução de alfa-sinucleína sob o promotor Gal1 e 0,1% de glicose. Incubar a cultura inoculada a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. No dia seguinte, inocular as células cultivadas durante a noite em 3 mililitros de SRD-URA fresco até que atinjam uma densidade óptica de 0,2 a 600 nanômetros.Em seguida, incubar a cultura por seis horas a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. Meça a densidade óptica a 600 nanômetros usando um espectrofotômetro. Em seguida, diluir as amostras para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros com água destilada estéril na faixa 1 de uma placa de 96 poços para equalizar o número de células em cada cultura.Realize diluições em série de 5 vezes das células de levedura adicionando 160 microlitros de água destilada estéril às próximas cinco pistas e garanta um volume total de 40 microlitros ao diluir em série as células em cada faixa. Use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de cada poço para detectar as amostras em placas de ágar SD-URA para os controles e placas de ágar SG-URA para monitorar a toxicidade. Incubar as placas manchadas de cabeça para baixo a 30 graus Celsius por quatro dias.Tire imagens das placas a cada 24 horas até o quarto dia e, em seguida, analise os dados comparando as diferenças de crescimento entre as cepas detectadas pelo olho. Inocular os três transformadores de levedura remendados por cepa em três mililitros de SRD-URA e incubar a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto durante a noite. No dia seguinte, medir a densidade óptica das células cultivadas durante a noite a 600 nanômetros e inocular as células em um total de 200 microlitros de SD-URA e SG-URA frescos em placas de 96 poços.Ajuste o volume final, incluindo as células, para 200 microlitros e ajuste a densidade óptica inicial da célula para 0,05 a 600 nanômetros. Ajuste as configurações do programa na placa de microtitulação. Defina a temperatura alvo para 30 graus Celsius, o tempo de intervalo para 15 minutos, a duração da agitação para 890 segundos, a amplitude de agitação para 5 milímetros e a medição como absorbância a 600 nanômetros.Incube a placa por 2-3 dias para que todas as cepas atinjam a fase estacionária em um leitor de microplacas. Analise os dados plotando a curva de crescimento. Inocular os transformadores de levedura remendados em 3 mililitros de SRD-URA e cultivá-los durante a noite a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto.No dia seguinte, reinocular as células cultivadas durante a noite em 3 mililitros de SRD-URA fresco a uma densidade óptica de 0,003 a 600 nanômetros, em seguida, incubar a cultura a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto, até que a densidade óptica atinja 0,2. Em seguida, adicione 300 microlitros de galactose a 20% e, em seguida, incube por mais 6 horas a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. Recolher um mililitro da cultura celular por centrifugação a 800 g durante 5 minutos e eliminar o sobrenadante.Ressuscite o pellet celular suavemente em 30 microlitros de água destilada. Prepare uma almofada de gel de agarose em uma lâmina de vidro. Ressuspeite as células e carregue cinco microlitros da ressuspensão celular na lâmina de vidro e cubra as células usando a almofada de agarose cortada para exame.Para realizar imagens microscópicas com uma objetiva de 100x, use a opção de captura de tela para gerar imagens usando o programa e selecione o campo brilhante para focar a célula com uma objetiva de 100x usando óleo de imersão. Mude para um filtro de fluorescência GFP e ajuste o tempo de exposição da imagem para entre 50 milissegundos e 300 milissegundos para obter uma imagem clara equilibrando a relação sinal-ruído. Abra o arquivo de imagem e analise os dados contando as células com base no número de focos nas células usando um software de análise de imagem.A expressão de sinucleína sob o promotor Gal1 no vetor PRS426 mostrou retardo de crescimento significativo na placa de ágar contendo galactose como indutor. A diferença no crescimento pela expressão de sinucleína também foi observada em culturas líquidas. Em ambas as condições de cultura, a sinucleína do tipo selvagem e variantes com mutações E46K ou A53T apresentaram defeitos de crescimento devido à toxicidade da sinucleína.No entanto, a variante de sinucleína A30p, que não forma agregados, apresentou fenótipo não tóxico. As cepas que apresentaram citotoxicidade grave mostraram focos de agregados de sinucleína, mas na variante A30p, uma forma menos tóxica de sinucleína foi difundida por todas as células. Para alcançar resultados reprodutíveis, é importante usar a célula no mesmo estágio de crescimento em cada experimento, particularmente quando você monitora fenótipos associados à sinucleína.Como mostramos em dados de microscópio fluorescente, a sinucleína pode formar agregados maiores. Portanto, ele pode ser simplesmente fracionado por centrifugação e pode ser quantificado por western blotting usando anticorpo específico de sinucleína. Esta técnica é aplicável para triagem de alto rendimento para encontrar novos fatores genéticos e compostos químicos que afetam a agregação da sinucleína.Assim, esperamos encontrar novos candidatos terapêuticos para a doença de Parkinson.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Gerando um &quot;humanizado&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Usando um método imunohistoquímico de montagem total para estudar a preservação do trato biliar em<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...