Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

Vi tackar James Bardwell och Tiago F. Outeiro för att de vänligt delar med sig av plasmiderna som innehåller α-synuklein. Changhan Lee fick finansiering från National Research Foundation of Korea (NRF) finansierad av den koreanska regeringen (MSIT) (bidrag 2021R1C1C1011690), grundforskningsprogrammet genom NRF finansierat av utbildningsministeriet (bidrag 2021R1A6A1A10044950) och den nya fakultetsforskningsfonden vid Ajou University.

1. Beredning av media och lösningar
<ol><li>Förberedelse av media<ol><li>För att bereda YPD-medium, lös upp 50 g YPD-pulver idH2Oför att göra en slutlig volym av 1 L. Autoklav för sterilisering. Förvaras i rumstemperatur (RT).</li>
		<li>För att göra YPD-agarmedium, lösa upp 50 g YPD-pulver och 20 g agar i 1 literdH2O. Autoklav för sterilisering. Efter kylning, häll på petriskålar. Förvaras vid 4 °C.</li>
		<li>För att göra SC med raffinos (SRd) -Ura-medium, lö...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

Med tanke på komplexiteten hos olika cellulära system hos människor är det fördelaktigt att använda jäst som modell för att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Även om det är nästan omöjligt att undersöka de komplexa cellulära interaktionerna i den mänskliga hjärnan med hjälp av jäst, ur ett encellsperspektiv, har jästceller en hög grad av likhet med mänskliga celler när det gäller den genomiska sekvenshomologin och grundläggande eukaryota cellulära processer <...

Parkinsons sjukdom (PD) är ett allvarligt problem för åldrande samhällen över hela världen. Aggregeringen av α-synuklein är nära associerad med PD, och proteinaggregat av α-synuklein används ofta som en molekylär biomarkör för att diagnostisera sjukdomen1. α-synuklein är ett litet surt protein (140 aminosyror i längd) med tre domäner, nämligen den N-terminala lipidbindande α-helixen, den amyloidbindande centrala domänen (NAC) och den C-terminala sura svansen2. Felveckningen av α-synuklein kan uppstå spontant och leder så småningom till bildandet av amyloidaggregat som kallas Lewy-kroppar3. α-synuklein kan bidra till patogenesen av PD på flera sätt. I allmänhet tror man att dess onormala, lösliga oligomera former som kallas protofibriller är giftiga arter som orsakar neuronal celldöd genom att påverka olika cellulära mål, inklusive synaptisk funktion3.
De biologiska modeller som används för att studera neurodegenerativa sjukdomar måste vara relevanta för människor med avseende på deras genom och cellbiologi. De bästa modellerna skulle vara mänskliga neuronala cellinjer. Dessa cellinjer är emellertid förknippade med flera tekniska problem, såsom svårigheter vid underhåll av kulturer, låg effektivitet av transfektion och hög kostnad4. Av dessa skäl krävs ett enkelt och pålitligt verktyg för att påskynda framstegen inom detta forskningsområde. Det är viktigt att verktyget ska vara lätt att använda för att analysera insamlade data. Ur dessa perspektiv har olika modellorganismer använts i stor utsträckning, inklusive Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, jäst och gnagare5. Bland dem är jäst den bästa modellorganismen eftersom genetisk manipulation är lätt och det är billigare än de andra modellorganismerna. Viktigast av allt har jäst höga likheter med mänskliga celler, såsom 60% sekvenshomologi till mänskliga ortologer och 25% nära homologi med mänskliga sjukdomsrelaterade gener6, och de delar också grundläggande eukaryot cellbiologi. Jäst innehåller många proteiner med liknande sekvenser och liknande funktioner som de i mänskliga celler7. Faktum är att jäst som uttrycker mänskliga gener har använts i stor utsträckning som ett modellsystem för att belysa cellulära processer8. Denna jäststam kallas humaniserad jäst och är ett användbart verktyg för att utforska funktionen hos mänskliga gener9. Humaniserad jäst har meriter för att studera genetiska interaktioner eftersom genetisk manipulation är väl etablerad i jäst.
I denna studie använde vi jästen Saccharomyces cerevisiae som modellorganism för att studera patogenesen av PD, särskilt för att undersöka bildandet av α-synukleinaggregat och cytotoxicitet10. För uttrycket av α-synuklein i den spirande jästen användes W303a-stammen för transformation med plasmider som kodar för de vilda och familjära PD-associerade varianterna av α-synuklein. Eftersom W303a-stammen har en auxotrofisk mutation på URA3 är den tillämplig för urval av celler som innehåller plasmider med URA3. Uttrycket av α-synuklein kodat i en plasmid regleras under GAL1-promotorn. Således kan uttrycksnivån för α-synuklein kontrolleras. Dessutom möjliggör fusionen av grönt fluorescerande protein (GFP) vid C-terminalregionen av α-synuklein övervakning av α-synukleinfocibildning. För att förstå egenskaperna hos de familjära PD-associerade varianterna av α-synuklein uttryckte vi också dessa varianter i jäst och undersökte deras cellulära effekter. Detta system är ett enkelt verktyg för screening av föreningar eller gener som uppvisar skyddande roller mot cytotoxiciteten hos α-synuklein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

Parkinsons sjukdom är den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen och kännetecknas av progressiv celldöd orsakad av bildandet av Lewy-kroppar som innehåller felveckade och aggregerade α-synuklein. α-synuklein är ett rikligt presynaptiskt protein som reglerar synaptisk vesikelhandel, men ackumuleringen av dess proteinhaltiga inklusioner resulterar i neurotoxicitet. Nya studier har visat att olika genetiska faktorer, inklusive bakteriella chaperoner, kan minska bildandet av α-synukleinaggregat in vitro. Det är dock också viktigt att övervaka antiaggregeringseffekten i cellen för att tillämpa detta som en potentiell behandling för patienterna. Det skulle vara idealiskt att använda neuronala celler, men dessa celler är svåra att hantera och tar lång tid att uppvisa anti-aggregeringsfenotypen. Därför krävs ett snabbt och effektivt in vivo-verktyg för ytterligare utvärdering av in vivo-antiaggregeringsaktivitet. Metoden som beskrivs här användes för att övervaka och analysera antiaggregeringsfenotypen i den humaniserade jästen Saccharomyces cerevisiae, som uttryckte humant α-synuklein. Detta protokoll visar in vivo-verktyg som kan användas för övervakning α-synukleininducerad cellulär toxicitet, liksom bildandet av α-synukleinaggregat i celler.

Det höga uttrycket av α-synuklein är känt för att vara kopplat till neuronal celldöd och PD i modellsystem av PD. Denna studie beskriver tre metoder för att övervaka cytotoxiciteten hos α-synuklein och focibildningen av aggregerad α-synuklein i jäst. Här överuttrycktes α-synukleinet i jäst, och fenotyperna av vildtyp α-synuklein och tre varianter av α-synuklein som kallas familjära mutanter av PD undersöktes (figur 1 och materialtabellen).
<p class="jo...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

En in vivo fysiologisk modell av α-synuklein krävs för att studera och förstå patogenesen av Parkinsons sjukdom. Vi beskriver en metod för att övervaka cytotoxicitet och aggregatbildning av α-synuklein med hjälp av en humaniserad jästmodell.

En metod för att studera α-synukleintoxicitet och aggregering med hjälp av en humaniserad jästmodell

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Detta är en enkel metod för att övervaka cellulära fenotyper och funktioner hos R-passkärnor. Det kan också ofta återvinnas i genomomfattande studier för att hitta de genetiska faktorer som påverkar stabiliteten hos R-passkärnor. Eftersom detta är en väletablerad motororganism är denna teknik lätt och kräver inte mycket tid och ansträngning jämfört med att använda mänskliga cellinjer eller djurmodeller.Aggregeringen av R-passkärnor är nära associerad med Parkinsons sjukdom. De proteiner eller kemikalier som sannolikt påverkar stabiliteten hos R-pass-kärnor kan testas i denna humaniserade jästmodell. Till att börja med, lappa tre enskilda kolonier på en SD-URA-agarplatta för val av celler som innehåller alfa-synukleinplasmider.Inokulera sedan de tre-lappade jästtransformationsformanterna per stam i 3 ml SRD-URA för selektiv tillväxt av jäst innehållande plasmiderna med 2% raffinos för hämning av induktionen av alfa-synuklein under Gal1-promotorn och 0,1% glukos. Inkubera den inokulerade kulturen vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Nästa dag, inokulera de odlade cellerna över natten till 3 ml färsk SRD-URA tills de når en optisk densitet på 0,2 vid 600 nanometer.Inkubera sedan kulturen i sex timmar vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Mät den optiska densiteten vid 600 nanometer med hjälp av en spektrofotometer. Späd sedan proverna till en optisk densitet av 0,5 vid 600 nanometer med sterilt destillerat vatten i bana 1 på en 96-brunnsplatta för att utjämna antalet celler i varje kultur.Utför 5-faldiga seriella utspädningar av jästcellerna genom att tillsätta 160 mikroliter sterilt destillerat vatten till de följande fem banorna och säkerställa en total volym på 40 mikroliter vid serieutspädning av cellerna i varje körfält. Använd en flerkanalig pipett för att överföra 10 mikroliter från varje brunn för att upptäcka proverna på SD-URA-agarplattor för kontrollerna och SG-URA-agarplattorna för att övervaka toxiciteten. Inkubera de fläckiga plattorna upp och ner i 30 grader celsius i fyra dagar.Ta bilder av plattorna var 24: e timme fram till dag fyra och analysera sedan data genom att jämföra tillväxtskillnaderna mellan stammar som upptäcks av ögat. Inokulera de tre lappade jästtransformanterna per stam till tre milliliter SRD-URA och inkubera vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut över natten. Nästa dag, mäta den optiska densiteten hos cellerna som odlas över natten på 600 nanometer och inokulera cellerna i totalt 200 mikroliter färsk SD-URA och SG-URA i 96-brunnsplattor.Justera den slutliga volymen inklusive cellerna till 200 mikroliter och justera den ursprungliga celloptiska densiteten till 0,05 vid 600 nanometer. Justera programinställningarna i mikrotiterplattan. Ställ in måltemperaturen på 30 grader, intervalltiden till 15 minuter, skakningstiden till 890 sekunder, skakningsamplituden till 5 millimeter och mätningen som absorbans vid 600 nanometer.Inkubera plattan i 2-3 dagar för att alla stammar ska nå den stationära fasen i en mikroplattläsare. Analysera data genom att rita tillväxtkurvan. Inokulera de lappade jästtransformationsmedlen till 3 ml SRD-URA och odla dem över natten vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut.Nästa dag, ominokulera de odlade cellerna över natten till 3 ml färsk SRD-URA till en optisk densitet av 0,003 vid 600 nanometer, inkubera sedan kulturen vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut tills den optiska densiteten når 0,2. Tillsätt sedan 300 mikroliter 20% galaktos och inkubera sedan i ytterligare 6 timmar vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Samla en milliliter av cellkulturen genom centrifugering vid 800 g i 5 minuter och kassera supernatanten.Återsuspendera cellpelleten försiktigt i 30 mikroliter destillerat vatten. Förbered en agarosgelkudde på en glasskiva. Återsuspendera cellerna och ladda fem mikroliter av cellresuspensionen på glasskivan och täck cellerna med den skurna agarosplattan för undersökning.För att utföra mikroskopisk avbildning med ett 100x-mål, använd skärmdumpalternativet för att generera bilder med programmet och välj ljusfält för att fokusera cellen med ett 100x-mål med nedsänkningsolja. Byt till ett GFP-fluorescensfilter och justera bildexponeringstiden till mellan 50 millisekunder och 300 millisekunder för att uppnå en tydlig bild genom att balansera signal-brusförhållandet. Öppna bildfilen och analysera data genom att räkna cellerna baserat på antalet foci i cellerna med hjälp av bildanalysprogramvara.Synukleinuttrycket under Gal1-promotorn i PRS426-vektorn visade signifikant tillväxtfördröjning på agarplattan innehållande galaktos som inducerare. Skillnaden i tillväxt genom synukleinuttryck observerades också i flytande kulturer. Under båda odlingsförhållandena visade synuklein av vild typ och varianter med E46K- eller A53T-mutationer tillväxtfel på grund av synukleintoxicitet.Synuklein A30p-varianten, som inte bildar aggregat, visade emellertid en giftfri fenotyp. Stammarna som uppvisade allvarlig cytotoxicitet visade foci av synukleinaggregat, men i A30p-varianten diffunderades en mindre toxisk form av synuklein genom cellerna. För att uppnå reproducerbara resultat är det viktigt att använda cellen i samma tillväxtstadium i varje experiment, särskilt när du övervakar synukleinassocierade fenotyper.Som vi har visat i fluorescerande mikroskopdata kan synuklein bilda större aggregat. Därför kan den helt enkelt fraktioneras genom centrifugering och kan kvantifieras genom western blotting med hjälp av synukleinspecifik antikropp. Denna teknik är tillämplig för screening med hög kapacitet för att hitta nya genetiska faktorer och kemiska föreningar som påverkar aggregeringen av synuklein.Därför hoppas vi kunna hitta nya terapeutiska kandidater för Parkinsons sjukdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Trombocyter vidhäftningsförmåga och sammanläggning enligt flödet med Mikroflödessystem Flow celler

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Tillväxtanalyser att utvärdera polyglutaminsystem toxicitet i jäst

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generera en &quot;humaniserad&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellinje Känslig för farmakologisk Hämning av Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Användning av en helmonterad immunhistokemisk metod för att studera gallringens innervation i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...