Name: a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

James Bardwell ve Tiago F. Outeiro'ya α-sinüklein içeren plazmidleri nazikçe paylaştıkları için teşekkür ederiz. Changhan Lee, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF) (hibe 2021R1C1C1011690), Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı'ndan (hibe 2021R1A6A1A10044950) ve Ajou Üniversitesi'nin yeni fakülte araştırma fonundan fon aldı.

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması
<ol><li>Medya hazırlama<ol><li>YPD ortamını hazırlamak için, sterilizasyon için 1 L. Otoklav nihai hacmi yapmak üzere 50 g YPD tozunu dH2O'da çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.</li>
		<li>YPD agar ortamı yapmak için, sterilizasyon için 50 g YPD tozu ve 20 g agar'ı 1 L dH2O. Otoklav içinde çözün. Soğuduktan sonra Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>SC'yi rafinoz (SRd)-Ura ort...

<ol>
	<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+Why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+synucleins:+&amp;#34;Here,+there+and+everywhere&amp;#34;.">Intracellular dynamics of synucleins: &amp;#34;Here, there and everywhere&amp;#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li><li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases.">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li><li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li><li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+neurodegenerative+diseases.">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li><li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+and+human+disease.">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li><li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+yeast+to+model+human+biology,+disease+and+evolution.">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 15 (6), (2022).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li><li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+systems+biology:+Model+organism+and+cell+factory.">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).</li><li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+aging:+learning+from+yeast+lessons.">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li><li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy.">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).</li><li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+implicated+in+familial+Parkinson's+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage.">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).</li><li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson's+disease.">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).</li><li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+in+Parkinson's+disease:+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application.">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+&#945;-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein &#945;-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+bacterial+amyloid+promotes+&#945;-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice.">A gut bacterial amyloid promotes &#945;-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111 (2020).</li><li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation.">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li></ol>

İnsanlardaki çeşitli hücresel sistemlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, mayayı insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanmak avantajlıdır. İnsan beyninin karmaşık hücresel etkileşimlerini maya kullanarak araştırmak neredeyse imkansız olsa da, tek hücreli bir bakış açısıyla, maya hücreleri, genomik dizi homolojisi ve temel ökaryotik hücresel süreçler açısından insan hücrelerine yüksek düzeyde benzerliğe sahiptir</sup...

Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk2 olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri3 adı verilen amiloid agregalarının oluşumuna yol açar. α-sinüklein, PD'nin patogenezine çeşitli şekillerde katkıda bulunabilir. Genel olarak, protofibriller adı verilen anormal, çözünür oligomerik formlarının, sinaptik fonksiyon3 de dahil olmak üzere çeşitli hücresel hedefleri etkileyerek nöronal hücre ölümüne neden olan toksik türler olduğu düşünülmektedir.
Nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılan biyolojik modeller, genomları ve hücresel biyolojileri açısından insanlarla ilgili olmalıdır. En iyi modeller insan nöronal hücre hatları olacaktır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, kültürlerin bakımındaki zorluklar, düşük transfeksiyon verimliliği ve yüksek masraf4 gibi çeşitli teknik sorunlarla ilişkilidir. Bu nedenlerle, bu araştırma alanındaki ilerlemeyi hızlandırmak için kolay ve güvenilir bir araç gereklidir. Önemli olarak, toplanan verileri analiz etmek için aracın kullanımı kolay olmalıdır. Bu perspektiflerden, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, maya ve kemirgenler5 dahil olmak üzere çeşitli model organizmalar yaygın olarak kullanılmıştır. Bunlar arasında maya en iyi model organizmadır, çünkü genetik manipülasyon kolaydır ve diğer model organizmalardan daha ucuzdur. En önemlisi, maya, insan ortologlarına% 60 dizi homolojisi ve% 25 insan hastalığınabağlı genlerle yakın homoloji 6 gibi insan hücrelerine yüksek benzerliklere sahiptir ve ayrıca temel ökaryotik hücre biyolojisini paylaşırlar. Maya, insan hücrelerindekilere benzer dizilere ve benzer işlevlere sahip birçok protein içerir7. Gerçekten de, insan genlerini ifade eden maya, hücresel süreçleri aydınlatmak için model bir sistem olarak yaygın olarak kullanılmıştır8. Bu maya suşu insanlaştırılmış maya olarak adlandırılır ve insan genlerinin işlevini keşfetmek için yararlı bir araçtır9. İnsanlaştırılmış maya, genetik etkileşimleri incelemek için değerlidir, çünkü genetik manipülasyon mayada iyi kurulmuştur.
Bu çalışmada, Saccharomyces cerevisiae mayasını PD'nin patogenezini incelemek, özellikle α-sinüklein agrega oluşumunu ve sitotoksisiteyi araştırmak için model organizma olarak kullandık10. Tomurcuklanan mayada α-sinükleinin ekspresyonu için, W303a suşu, α-sinükleinin vahşi tip ve ailesel PD ile ilişkili varyantlarını kodlayan plazmidlerle transformasyon için kullanılmıştır. W303a suşu URA3 üzerinde oksotrofik bir mutasyona sahip olduğundan, URA3 ile plazmidler içeren hücrelerin seçimi için geçerlidir. Bir plazmidde kodlanmış α-sinüklein ekspresyonu, GAL1 promotörü altında düzenlenir. Böylece, α-sinükleinin ekspresyon seviyesi kontrol edilebilir. Ek olarak, yeşil floresan proteinin (GFP) α-sinükleinin C-terminal bölgesinde füzyonu, α-sinüklein odaklarının oluşumunun izlenmesini sağlar. α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantlarının özelliklerini anlamak için, bu varyantları mayada da ifade ettik ve hücresel etkilerini inceledik. Bu sistem, α-sinükleinin sitotoksisitesine karşı koruyucu rol oynayan bileşikleri veya genleri taramak için basit bir araçtır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TAESHIN</td>
			<td>0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>diversified biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Gas permeable sealing membrane for microtiter plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>2712120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>6638-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>Labtron</td>
			<td></td>
			<td>model: SHI1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Vision scientific</td>
			<td></td>
			<td>model: VS-1203PV-O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiAc</td>
			<td>sigma</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30050303 01</td>
			<td>Model: Infinite 200 pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 20-200 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>gilson</td>
			<td>FA10009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4338</td>
			<td>average mol wt 3,350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &#38; Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A30P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein A53T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein E46K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRS426 GAL1 promoter &#945;-synuclein WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outeiro, T. F. &#38; Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>6131 05560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W303a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Present from James Bardwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1547.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study &#945;-synuclein toxicity and aggregation using a humanized yeast model

Parkinson hastalığı ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve yanlış katlanmış ve agrega olmuş α-sinüklein içeren Lewy cisimlerinin oluşumunun neden olduğu ilerleyici hücre ölümü ile karakterizedir. α-sinüklein, sinaptik vezikül kaçakçılığını düzenleyen bol miktarda presinaptik bir proteindir, ancak proteinli inklüzyonların birikmesi nörotoksisiteye neden olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyel şaperonlar da dahil olmak üzere çeşitli genetik faktörlerin, in vitro α-sinüklein agregalarının oluşumunu azaltabileceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bunu hastalar için potansiyel bir tedavi olarak uygulamak için hücredeki anti-agregasyon etkisini izlemek de önemlidir. Nöronal hücreleri kullanmak ideal olacaktır, ancak bu hücrelerin ele alınması zordur ve anti-agregasyon fenotipini sergilemek uzun zaman alır. Bu nedenle, in vivo anti-agregasyon aktivitesinin daha fazla değerlendirilmesi için hızlı ve etkili bir in vivo araç gereklidir. Burada açıklanan yöntem, insan α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya Saccharomyces cerevisiae'deki anti-agregasyon fenotipini izlemek ve analiz etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, α-sinüklein kaynaklı hücresel toksisiteyi ve ayrıca hücrelerde α-sinüklein agregalarının oluşumunu izlemek için kullanılabilecek in vivo araçları göstermektedir.

α-sinükleinin yüksek ekspresyonunun, PD'nin model sistemlerinde nöronal hücre ölümü ve PD ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, α-sinükleinin sitotoksisitesini ve mayada agrega α-sinükleinin odak oluşumunu izlemek için üç yöntem açıklanmaktadır. Burada, α-sinüklein mayada aşırı eksprese edildi ve vahşi tip α-sinükleinin fenotipleri ve PD'nin ailesel mutantları olarak bilinen üç α-sinüklein varyantı incelendi (Şekil 1 ve Malzeme T...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study Î±-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model at JoVE.com

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Bu, hücresel fenotipleri ve R-pass çekirdeklerinin özelliklerini izlemek için basit bir yöntemdir. Ayrıca, R-pass çekirdeklerinin stabilitesini etkileyen genetik faktörleri bulmak için genom çapında yapılan çalışmalarda sıklıkla geri kazanılabilir. Bu köklü bir motor organizma olduğundan, bu teknik kolaydır ve insan hücre hatlarını veya hayvan modellerini kullanmaya kıyasla fazla zaman ve çaba gerektirmez.R-pass çekirdeklerinin agregasyonu Parkinson hastalığı ile yakından ilişkilidir. R-pass çekirdeklerinin stabilitesini etkilemesi muhtemel proteinler veya kimyasallar bu İnsanlaştırılmış maya modelinde test edilebilir. Başlamak için, alfa-sinüklein plazmidleri içeren hücrelerin seçimi için üç tek koloni bir SD-URA agar plakasına yama yapın.Daha sonra, Gal1 promotörü ve% 0.1 glikoz altında alfa-sinüklein indüksiyonunun indüksiyonunun inhibisyonu için% 2 rafinoz ile plazmidleri içeren mayanın seçici büyümesi için suş başına üç yamalı maya dönüştürücülerini 3 mililitre SRD-URA'ya aşılayın. Aşılanmış kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, gece kültürlü hücreleri, 600 nanometrede 0.2'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 3 mililitre taze SRD-URA'ya aşılayın.Daha sonra, kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede altı saat boyunca inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Daha sonra, her kültürdeki hücre sayısını eşitlemek için numuneleri 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa kadar 96 kuyucuklu bir plakanın 1. şeridinde steril damıtılmış suyla seyreltin.Sonraki beş şeride 160 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyerek maya hücrelerinin 5 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve her şeritteki hücreleri seri olarak seyreltirken toplam 40 mikrolitre hacim sağlayın. Kontroller için SD-URA agar plakalarındaki numuneleri ve toksisiteyi izlemek için SG-URA agar plakalarındaki numuneleri tespit etmek üzere her bir kuyucuktan 10 mikrolitre aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Benekli plakaları dört gün boyunca 30 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.Dördüncü güne kadar her 24 saatte bir plakaların görüntülerini alın ve ardından gözle tespit edilen suşlar arasındaki büyüme farklılıklarını karşılaştırarak verileri analiz edin. Suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü üç mililitre SRD-URA'ya aşılayın ve gece boyunca dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 600 nanometrede gece boyunca kültürlenen hücrelerin optik yoğunluğunu ölçün ve hücreleri 96 delikli plakalarda toplam 200 mikrolitre taze SD-URA ve SG-URA'ya aşılayın.Hücreler de dahil olmak üzere son hacmi 200 mikrolitreye ayarlayın ve ilk hücre optik yoğunluğunu 600 nanometrede 0.05'e ayarlayın. Mikrotitre plakasındaki program ayarlarını yapın. Hedef sıcaklığı 30 santigrat dereceye, aralık süresini 15 dakikaya, sarsıntı süresini 890 saniyeye, sarsıntı genliğini 5 milimetreye ve ölçümü 600 nanometrede absorbans olarak ayarlayın.Tüm suşların bir mikroplaka okuyucuda sabit faza ulaşması için plakayı 2-3 gün boyunca inkübe edin. Büyüme eğrisini çizerek verileri analiz edin. Yamalı maya dönüştürücülerini 3 mililitre SRD-URA'ya aşılayın ve dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede gece boyunca kültürleyin.Ertesi gün, gece kültürlü hücreleri 3 mililitre taze SRD-URA'ya 600 nanometrede 0.003 optik yoğunluğa yeniden aşılayın, ardından optik yoğunluk 0.2'ye ulaşana kadar kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra 300 mikrolitre% 20 galaktoz ekleyin ve daha sonra dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede 6 saat daha inkübe edin. 5 dakika boyunca 800 g'da santrifüjleme yoluyla hücre kültürünün bir mililitresini toplayın ve süpernatanı atın.Hücre peletini 30 mikrolitre damıtılmış suda nazikçe askıya alın. Bir cam slayt üzerinde bir agaroz jel ped hazırlayın. Hücreleri yeniden askıya alın ve cam slayta hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini yükleyin ve inceleme için kesilmiş agaroz pedi kullanarak hücreleri örtün.100x objektifle mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmek için, programı kullanarak görüntü oluşturmak için ekran yakalama seçeneğini kullanın ve daldırma yağı kullanarak hücreyi 100x objektifle odaklamak için parlak alanı seçin. GFP floresan filtresine geçin ve sinyal-gürültü oranını dengeleyerek net bir görüntü elde etmek için görüntü pozlama süresini 50 milisaniye ile 300 milisaniye arasında ayarlayın. Görüntü dosyasını açın ve görüntü analiz yazılımını kullanarak hücrelerdeki odak sayısına göre hücreleri sayarak verileri analiz edin.PRS426 vektöründeki Gal1 promotörü altındaki sinüklein ekspresyonu, indükleyici olarak galaktoz içeren agar plakasında önemli büyüme geriliği gösterdi. Sinüklein ekspresyonu ile büyümedeki fark sıvı kültürlerde de gözlenmiştir. Her iki kültür koşulunda da, vahşi tip sinüklein ve E46K veya A53T mutasyonlu varyantlar, sinüklein toksisitesine bağlı büyüme kusurları göstermiştir.Bununla birlikte, agrega oluşturmayan sinüklein A30p varyantı, toksik olmayan bir fenotip göstermiştir. Şiddetli sitotoksisite sergileyen suşlar, sinüklein agregalarının odaklarını gösterdi, ancak A30p varyantında, hücreler boyunca daha az toksik bir sinüklein formu yayıldı. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, hücreyi her deneyde aynı büyüme aşamasında, özellikle sinükleinle ilişkili fenotipleri izlerken kullanmak önemlidir.Floresan mikroskop verilerinde gösterdiğimiz gibi, sinüklein daha büyük agregalar oluşturabilir. Bu nedenle, santrifüjleme ile basitçe fraksiyone edilebilir ve sinükleine özgü antikor kullanılarak batı lekelenmesi ile ölçülebilir. Bu teknik, sinükleinin agregasyonunu etkileyen yeni genetik faktörleri ve kimyasal bileşikleri bulmak için yüksek verimli tarama için geçerlidir.Bu nedenle, Parkinson hastalığı için yeni terapötik adaylar bulmayı umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...