이 방법은 바이러스 감염 동안 폐렴 구균이 무증상 식민지 개척자에서 질병을 유발하는 병원체로의 전환을 연구하기위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 그것은 인간에게서 일어나는 일을 더 가깝게 모방합니다. 이 모델은 감수성 숙주에서 이차성 폐렴구균성 폐렴에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 중요한 도구가 될 수 있다.
이 모델은 노화의 감수성을 재현합니다. 따라서 숙주의 어떤 측면이 나이가 들어감에 따라 결함이 있는지 이해하고 취약한 노인 숙주에 대한 치료 옵션을 맞춤화하는 데 사용할 수 있습니다. 폐렴구균 생물막을 성장시키는 것은 균주마다 시간이 다르기 때문에 어려운 일입니다.
제 조언은 동물 연구를 실행하기 전에 생물막을 성장시키는 것입니다. H292 세포가 100% 융합되면 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 웰 당 250 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정시키고 얼음 위에서 1 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
Strake streptococcus pneumoniae 혈액 한천 플레이트에 관심 균주를 넣고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 CDM과 Oxyrase 1 밀리리터를 첨가하여 플레이트에서 박테리아를 씻어 내고 1 밀리리터 피펫 팁의 측면을 사용하여 박테리아 콜로니를 부드럽게 들어 올려 플레이트의 박테리아를 화학적으로 정의 된 신선한 배지 또는 CDM 플러스 옥시 라아제에 접종합니다. 박테리아 배양물을 CDM 플러스 옥시라제에서 0.05의 출발 OD600으로 희석한다.
그런 다음 섭씨 37도에서 느슨하게 덮인 50밀리리터 원추형 튜브에서 OD 0.2에 도달할 때까지 5% 이산화탄소에서 박테리아를 성장시킵니다. 다음으로 박테리아 배양 튜브를 소용돌이칩니다. 고정된 H292 세포에 배양물 0.5밀리리터를 시딩하고 웰당 CDM 플러스 옥시라제 배지 0.5밀리리터를 추가합니다.
박테리아가 없는 대조군 웰에 CDM과 Oxyrase를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 34도와 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 배양합니다. 초기 파종 후 12 시간마다 0.5 밀리리터의 배지를 신선한 CDM과 옥시 라제로 부드럽게 교체하십시오.
생물막 형성을 방해하지 않도록 주의하십시오. 플레이트 바닥에 생물막이 있는지 확인하고 생물막 성장으로 인해 시간이 지남에 따라 흐림이 증가하는 것을 확인합니다. 48시간 후, 상층액을 제거하고, 1밀리리터의 PBS로 생물막을 2회 세척한다.
그런 다음 1밀리리터의 신선한 CDM에 생물막을 다시 현탁하고 위아래로 세게 피펫하여 생물막을 들어 올립니다. 각 박테리아 균주에 대해 모든 웰의 배양액을 50밀리리터 튜브에 풀링합니다. 단단히 덮인 튜브를 위아래로 여러 번 부드럽게 기울여 잘 섞습니다.
다음으로, 40 % 글리세롤과 CDM을 동일한 부피로 첨가하여 최종 농도가 20 % 글리세롤인 박테리아 현탁액을 얻습니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 1밀리리터를 분취하고 드라이아이스에서 급속 동결한 다음 섭씨 영하 80도에서 저장합니다. 생물막 성장 분취액을 얼음 위에서 해동하고 1, 700 G에서 5분 동안 회전시킨다.
펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 펠릿을 PBS 1 밀리리터에 재현 탁하여 세척하고 다시 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 원하는 농도에 도달하는 데 필요한 부피로 펠릿을 다시 현탁합니다.
C57 검정색 6마리 수컷 마우스를 5회 10회 6번째 콜로니 형성 단위 또는 CFU로 5 마이크로리터의 희석된 접종물을 각 나리스에 피펫팅하여 비강내 접종한다. 접종 후 마우스를 단단히 잡고 볼륨이 흡입 될 때까지 머리를 안정시킵니다. 바이러스가 해동되면 PBS에서 원하는 농도로 바이러스를 희석합니다.
마취 전에 마우스의 눈에 안과용 윤활제를 바르십시오. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 혀를 입 밖으로 빼내고 액체의 양을 기관 아래로 피펫팅하여 인플루엔자 A 바이러스 또는 IAV의 50마이크로리터의 20 플라크 형성 단위 또는 PFU로 마취된 마우스를 즉시 감염시킵니다. 회복 후, 앞서 설명한 접종 방법을 사용하여 IAV 200 PFU 10 마이크로리터를 비강 내 접종합니다.
폐 채취를 위해 해부 가위를 사용하여 노출된 흉곽의 측면을 자르고 갈비뼈를 마우스 머리 쪽으로 부드럽게 당겨 심장을 노출시킵니다. PBS로 미리 채워진 25밀리리터 주사기에 부착된 10게이지 바늘을 우심실에 삽입하고 천천히 관류를 시작합니다. 성공적인 관류의 지표로 폐 표백을 찾으십시오.
폐 조직이 부러지지 않도록 천천히 씻어 내십시오. 집게로 심장을 들어 올리고 폐와 심장을 분리하기 위해 절개하십시오. 분리되면 집게로 폐의 모든 엽을 집어 들고 멸균 PBS가 있는 접시에 헹구어 잔류 혈액을 제거합니다.
페트리 접시에 폐를 작은 조각으로 다듬고 잘 섞는다. 폐 혼합물의 절반을 제거하여 박테리아 CFU 또는 바이러스 PFU를 결정하고 균질화를 위해 0.5 밀리리터의 PBS로 미리 채워진 둥근 바닥 15 밀리리터 튜브에 넣습니다. 유세포 분석을 위해 폐의 나머지 절반을 제거하고 각 웰에 0.5밀리리터의 RP10으로 미리 채워진 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트에 넣습니다.
처리 될 때까지 실온에서 방치하십시오. 수집된 조직을 균질화하려면 균질화 프로브를 70% 에탄올에 넣고 60% 전력에서 30초 동안 균질기를 켜서 세척합니다. 멸균수에서 이 단계를 10초 동안 반복합니다.
각 조직을 1분 동안 균질화합니다. 박테리아 수의 열거를 위해, 혈액 한천 플레이트에 일련의 희석액을 플레이트. 총 CFU를 계산하려면 10마이크로리터를 사용하여 각 샘플의 최종 부피(밀리리터)를 도금하고 기록하십시오.
밀리리터 젠타마이신당 3마이크로그램이 보충된 혈액 한천 플레이트에 비인두 샘플을 플레이트하여 다른 미생물의 성장을 억제하면서 S pneumoniae의 성장을 선택합니다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 배양합니다. 유세포 분석을 위해 폐 샘플이 들어 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 소화 완충액을 추가합니다.
플레이트를 45분 내지 1시간 동안 배양한다. 다음으로 P-1000 마이크로 피펫을 사용하여 소화된 폐를 움직여 필터에 올려 놓습니다. 그런 다음 3 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 샘플을 으깬다.
생물막 성장 S.pneumoniae 접종물은 체계적인 확산을 피하면서 비인두로 제한된 일관된 폐렴구균 운반을 초래합니다. S pneumoniae, IAV 동시 감염된 마우스에서의 질환 발현은 박테리아 균주에 의존적이었다. 어떤 균주들 사이에서 비인두의 박테리아 수에는 유의미한 차이가 없었지만, S 폐렴, TIGR4 및 D39, 그러나 EF3030은 IAV 감염 후 48시간까지 폐로 전파되지 않았습니다.
S pneumoniae TIGR4에 감염된 마우스의 40%가 폐에 박테리아 전파를 나타냈고 그 중 절반이 세균이 되었습니다. S pneumoniae D39에 감염된 마우스는 폐에 100% 전파되는 것으로 나타났고 그 중 절반은 균혈증을 경험했습니다. 박테리아 균주에 관계없이 전체 생존율을 추적함에 있어서, 동시 감염된 마우스의 생존율은 S 폐렴에 단독으로 도전한 마우스보다 유의하게 낮았다.
이 모델은 또한 IAV 감염 후 폐에서 다양한 면역 세포의 존재를 평가하는 데 사용되었습니다. 박테리아 균주 D39 및 TIGR4는 호중구 및 단핵구와 같은 순환에서 염증성 면역 세포의 유입에서 기준선보다 유의한 증가를 유도했지만 EF3030은 그렇지 않았습니다. IAV 감염 단독으로 NK 세포 및 감마 델타 T 세포와 같은 면역 세포의 유입이 기준선보다 크게 증가했습니다.
이러한 항바이러스 반응은 바이러스 챌린지 전에 S pneumoniae에 비강내 감염된 마우스에서 상당히 둔화되었습니다. 단독으로 감염된 마우스에서 바이러스 역가는 젊은 코호트와 노인 코호트 간에 변하지 않았습니다. 늙은 쥐는 더 일찍 그리고 훨씬 더 심각한 질병 징후를 보였고 24시간 이내에 더 빨리 사망한 반면, 젊은 대조군은 감염에서 더 잘 살아남았습니다.
운반과 질병을 별개의 단계로 분리하면 질병 진행의 여러 단계에서 중요한 면역 반응과 박테리아 및/또는 바이러스 요인을 모두 검사할 수 있습니다. 우리는 이 모델이 질병 진행의 여러 단계와 다양한 숙주에서 다른 다미생물 상호 작용 및 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 다른 실험실에서 적용되기를 바랍니다.
