Name: cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada und der Canadian Lyme Lyme Disease Foundation (AB und VL), dem Schwedischen Forschungsrat (SB, M-LF und IN), TAČR GAMA 2 Projekt - "Unterstützung der Verifizierung des Anwendungspotenzials 2.0 am Biologiezentrum CAS" (TP01010022) (MG und NR) und durch einen Zuschuss des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik NV19-05-00191 (MG und NR) unterstützt. Wir danken S. Vranjes (2021, AG Rudenko) für das Bild in Abbildung 4 und J. Thomas-Ebbett (2021, AG Lloyd) für die Bilder in Abbildung 5. Wir danken allen Forschern, die zu diesem Gebiet beigetragen haben, und entschuldigen uns bei denen, deren Arbeiten wir aus Platzgründen nicht zitieren konnten.

Alle Studien mit Proben, die von menschlichen Probanden entnommen wurden, wurden vom Institutional Review Board der jeweiligen Universität und/oder medizinischen Einrichtung genehmigt, und die Teilnehmer wurden vor der Entnahme der Proben eine schriftliche Einverständniserklärung einholen. Alle Studien mit Tierproben wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommission durchgeführt. Gegebenenfalls wurden Genehmigungen für Umweltprobenahmen eingeholt.
HINWEIS:...

Die Laborkultur von Bakterien ist das Sprungbrett für die Forschung. Der tiefgreifende Vorteil, den die Fähigkeit zur Kultivierung mit sich bringt, wird durch den mehr als ein Jahrhundert dauernden Kampf gegen die Kultivierung von Treponema pallidum, der Spirochäte, die der ätiologische Erreger der Syphilis ist, veranschaulicht44. Borrelien-Spirochäten sind auch eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich 23,24,34,44,45,46,47,48,49....

Borrelien sind eine Gattung von Spirochätenbakterien, die drei Hauptgruppen umfasst: die Gruppe der Lyme-Borreliose (LB), die Gruppe des Rückfallfiebers (RF) und eine weniger gut charakterisierte Gruppe, die anscheinend auf Reptilien beschränkt ist. Die Borrelien-Taxonomie ist mit dem Aufkommen molekularer Methoden, die Genom- und Proteomvergleiche ermöglichen, im Fluss, wie es bei den meisten anderen taxonomischen Gruppen der Fall ist 1,2,3,4,5,6,7. Die LB-Gruppe (auch Borreliose-Gruppe genannt) wird traditionell als Borrelia burgdorferi sensu lato bezeichnet, nach ihrem am besten charakterisierten Mitglied Borrelia burgdorferi sensu stricto. In diesem Artikel wird die derzeit am weitesten verbreitete Terminologie verwendet: die LB-, die RF- und die Reptilien-assoziierte Gruppe, und die Kulturprotokolle für die LB- und die RF-Gruppe beschrieben.
Wie für ein Mitglied der Familie Spirochaetaceae zu erwarten, können Borrelien die charakteristisch lange und dünne Spiralform annehmen, typischerweise 20-30 μm lang und 0,2-0,3 μm breit. Borrelienzellen sind jedoch hochgradig pleomorph und können aufgrund ihrer komplexen zellulären und genetischen Struktur sowohl in Kultur als auch in vivo viele andere Formen annehmen 1,8. In seiner Spirochätalform resultiert die planare Sinuswellenmorphologie aus der Rotation der axialen Endoflagellen im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Diese Struktur ermöglicht es den Zellen, sehr beweglich zu sein, wobei die äußere Membran Proteine enthält, die es der Zelle ermöglichen, mit dem Wirtsgewebe zu interagieren 9,10. Die Expression der Proteine der äußeren Membran ist streng reguliert und beeinflusst nicht nur die Invasion des Wirtsgewebes, sondern auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts11. Diese komplexe Genexpression ermöglicht es den Borrelienzellen, zwischen den sehr unterschiedlichen Umgebungen von Wirbeltierwirten und wirbellosen Vektoren zu pendeln. Das Genom von Borrelien ist bei Prokaryoten ungewöhnlich und besteht aus einem linearen und nicht aus einem zirkulären Chromosom. Neben dem linearen Chromosom enthalten Borrelien-Arten 7-21 Plasmide, einige linear und einige kreisförmig. Die Plasmide beherbergen die Mehrheit der Gene, die für die Anpassung und Virulenz des Wirts erforderlich sind, und es wird angenommen, dass die zirkulären Plasmide, die aus Prophagen stammen, für den Großteil des horizontalen Genflusses zwischen Spirochätalzellen verantwortlichsind 12,13. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Wirtsanpassung verlieren einige, möglicherweise viele oder alle Mitglieder der Lyme-Borreliose-Gruppe Plasmide in Kultur14. Der am besten untersuchte "laborangepasste" Stamm von B. burgdorferi, B31, weist nur sieben der neun Plasmide auf, die in Wildisolaten dieser Art gefunden wurden15. In ähnlicher Weise verliert B. garinii Plasmide in Kultur16. Einige Studien haben gezeigt, dass RF-Spezies und B. miyamotoi Plasmide behalten, wenn sie kultiviert werden 14,17, aber neuere Arbeiten zeigen veränderte Plasmide und Infektiosität bei langfristiger In-vitro-Kultivierung 18.
Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit14,17. Die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben detektiert direkt replizierende Krankheitserreger und liefert Ausgangsmaterial für die Forschung14,17. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung der Spirochäten der LB-Gruppe sowie von RF-Borrelien und B. miyamotoi erforderlich sind. Das Basismedium für die Züchtung von Borrelia-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder das kommerziell erhältliche BSK-H), mit oder ohne Antibiotika, um das Wachstum kontaminierender Prokaryoten zu reduzieren. Dieses Medium wurde von einem Medium adaptiert, das ursprünglich zur Unterstützung von RF Borrelia19 verwendet wurde, und wurde von Stoenner20 und dann von Barbour21 weiter modifiziert. Seitdem wurden viele Modifikationen entwickelt, von denen jede Auswirkungen auf die bakterielle Physiologie hat, die das Wachstum, die Infektiosität und die Pathogenität beeinflussen können22. Dieses Medium unterstützt zuverlässig das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen und wurde verwendet, um Spirochäten aus Zecken-, Säugetier- und klinischen Proben zu isolieren23. Die neuere Variante, modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium, kann bei der Isolierung neuer Borrelienisolate aus Umweltproben einen besseren Isolationserfolg, eine bessere Morphologie und eine bessere Motilität bieten, wenn die Anzahl der in der Probe vorhandenen Spirochäten, die für die Aussaat der Kultur zur Verfügung stehen, gering ist23,24. In allen Fällen hängt der Erfolg der Kultivierung entscheidend vom frisch zubereiteten Medium und der Verwendung geeigneter Zutaten ab. Nicht alle kommerziellen Inhaltsstoffe produzieren ein hochwertiges Medium. Beimpfte Kulturen können bequem und ohne Schütteln in einem herkömmlichen Inkubator bei 32-34 °C in Gegenwart einer geringen Menge an Restsauerstoff in der Umgebung inkubiert werden. Borrelien-Spirochäten sind anaerob Pflanzen, sind aber in der Natur Schwankungen der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration ausgesetzt und reagieren mit Veränderungen der Genexpression26,27,28,29. Daher sollten Genexpressions-, Wachstums- und andere Stoffwechselstudien den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt mit Hilfe eines sauerstoffkontrollierten Inkubators oder einer anaeroben Kammer kontrollieren. In Kultur werden Kulturen wöchentlich oder häufiger entweder mit Dunkelfeldmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie auf das Vorhandensein von Spirochäten überprüft. Kulturausstriche können entweder mit Silberfärbungen, Immunhistochemie oder durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme gefärbt werden29,30. Die PCR mit anschließender DNA-Sequenzierung ist eine empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis und zur genetischen Identifizierung bzw. Bestätigung der Borrelienspezies 30,31,32,33.
Es gibt viele kleinere Variationen von BSK-II, und einige sind im Handel erhältlich. Das hier in Abschnitt 1 beschriebene Protokoll wurde von Barbour (1984)21 übernommen. Flüssiges MKP-Medium ist ein neueres Medium und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Es wird gemäß einem zuvor berichteten Protokoll33,34 hergestellt, das, ähnlich wie BSK-Medium, aus zwei Schritten besteht: der Herstellung des Basismediums und der Herstellung des vollständigen Mediums. Borrelien-Nährmedium kann mit oder ohne Antibiotika hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben; das Antibiotikagesetz zur Verringerung kontaminierender Bakterien, die bei der Impfung mit klinischen Proben oder Umweltproben eingeführt werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben; Bei der Inokulation mit reiner Borrelien-Sp.-Kultur sind möglicherweise keine Antibiotika erforderlich. Es ist oft wichtig, langfristige Borrelienvorräte anzulegen, und ein Protokoll dafür wird in Abschnitt 5 beschrieben. Abschnitt 6 beschreibt die Verwendung dieser Medien zur Isolierung reiner Borrelien-Sensu-Lato-Klone aus klinischen oder Umweltproben. Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze36; Im Folgenden finden Sie eine, die sich als wirksam erwiesen hat. Das in diesem Protokoll verwendete Beschichtungsmedium ist eine Modifikation des BSK-II-Beschichtungsmediums37 und des MKP-Mediums34 (wobei das Kaninchenserum auf 10 % erhöht wurde38).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#160;&#181;m Sterile syringe filter&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT10XLS3</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229011B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>188261</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309661</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT200</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Screw Cap Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933C</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipettes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229025B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Sterile syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7409</td>
			<td>Source is important - see note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229006B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229421</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 ml MKP glass tubes&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Nr. 26 135 115</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1654</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Brucella broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>211088</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>302419100</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (yellow top - ACD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD&#160;Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]&#160;</td>
			<td>Darlynn biologicals</td>
			<td>BB83-500</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model 5430</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid TrisodiumSaltDihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8532 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>21540 500 mL</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-510-018</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Tubes (Nalgene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Petri with stacking ring 100 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7741</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model 1545</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for filter sterilization</td>
			<td>Millipore 0.22&#956;m GPExpressPLUS Membrane</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco BD</td>
			<td>214340 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>99449-20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021 1 kg</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemafuge (Hematocrit &#38; Immuno hematology centrifuge )</td>
			<td>Labwissen</td>
			<td>Model 3220</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H-3784 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucoseamine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A-3286 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neopeptone</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>211681 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hematocytometer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope&#160;</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Standard Balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>model TS200S</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8574 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16-120-032</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-4505&#160; 100 mL</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761&#160;&#160;&#160;&#160; 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufametaxazole&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Yeastolate</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>255752 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-044</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1056</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia

Die Borrelien bestehen aus drei Artengruppen, der Lyme-Borreliose-Gruppe (LB), die auch als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) bekannt ist und kürzlich in Borreliella, die Rückfallfiebergruppe (RF) Borrelien und eine dritte reptilienassoziierte Gruppe von Spirochäten umklassifiziert wurde. Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit, da die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben replizierende Krankheitserreger direkt detektiert und Ausgangsmaterial für die Forschung liefert. Borrelien und Borreliella-Spirochäten sind anspruchsvoll und langsam wachsend und werden daher üblicherweise nicht für klinische Zwecke kultiviert. Für die Forschung ist jedoch Kultur notwendig. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung von LB- und RF-Spirochäten erforderlich sind, einschließlich aller anerkannten Arten aus dem B. burgdorferi s.l.-Komplex, einschließlich B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis undRF-Spirochäten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis und B. miyamotoi. Das Basismedium für die Zucht von LB- und RF-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder BSK-H), das das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen zuverlässig unterstützt. Um neu isolierte Borrelienisolate aus Zecken- oder Wirtsproben züchten zu können, bei denen die anfängliche Spirochätenzahl im Inokulum niedrig ist, wird modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium bevorzugt. Dieses Medium unterstützt auch das Wachstum von B. miyamotoi. Der Erfolg der Kultivierung von RF-Spirochäten hängt auch entscheidend von der Qualität der Inhaltsstoffe ab.

Borrelien-Nährmedien BSK und MKP sowie Varianten sind reichhaltige Nährmedien mit Inhaltsstoffen, die nacheinander vorbereitet und sterilisiert werden müssen. Bei korrekter Zubereitung sollte BSK-Medium rot-orange und klar sein (Abbildung 1). Trübungen und Niederschläge, die nach der Erwärmung bestehen bleiben, deuten auf problematische Inhaltsstoffe, Mediumproduktion oder Kontamination hin. Ein solches Medium wird am besten verworfen. Wenn Gelatine zu BSK und mit MKP hinzugef...

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Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

Die In-vitro-Kultur ist eine direkte Nachweismethode für das Vorhandensein lebender Bakterien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Kultivierung verschiedener Borrelien-Spirochäten, einschließlich der Borrelia burgdorferi sensu lato-Komplexes, der Rezidivfieber-Borrelienarten und der Borrelia miyamotoi. Diese Arten sind anspruchsvoll und wachsen langsam, können aber kultiviert werden.

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelien sind eine Gattung von Spirochäten, die drei Hauptarten umfasst. Die Lyme-Borreliose-Gruppe, die Rückfallfieber-Gruppe und die weniger gut charakterisierte Gruppe, die bei Reptilien zu finden ist. Viele Borrelienarten sind pathogen.Die Bakterienkultur ist der Goldstandard für den Nachweis von Infektionen. Dies gilt sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit. Die Kultivierung von Bakterien aus Körperflüssigkeit und Gewebe bestätigt, dass die Bakterien sowohl lebensfähig sind als auch sich vermehren.Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung und Konservierung der Lyme-Borreliose-Gruppe von Spirochäten, Rückfallfieber-Borrelien und Borrelia miyamotoi erforderlich sind. Es werden Methoden für die Kultivierung von zuvor isolierten Arten und Stämmen sowie für neue Isolate und monoklonale Isolate aus Umwelt- oder Säugetierquellen bereitgestellt. Marie-Line Faucillion, Postdoktorandin, und Ingela Nilsson, Technikerin aus dem Bergstrom Lab, Anne Berthold, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Lloyd Lab, und Maryna Golovchenko, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Rudenko Lab, demonstrieren das Verfahren.Besorge dir zunächst die Reagenzien, die für die Herstellung eines Liters Barbara-Stoner-Kelly- oder BSK-II-Medium erforderlich sind. Beginnen Sie mit dem Auflösen des BSA in einem Becherglas, indem Sie das Wasser umrühren. Fügen Sie dann alle trockenen Chemikalien hinzu und lassen Sie sie sich auflösen, bevor Sie CMRL hinzufügen.Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 7,6 ein. Verwenden Sie bei Bedarf eine molare Natronlauge. Als nächstes fügen Sie dem Medium Kaninchenserum in einer Konzentration von sechs bis 10 % hinzuWenn das Bakterienwachstum nicht stark ist, fügen Sie dem Medium ein weiteres bis 2%iges Serum hinzu.Anschließend sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22-Mikron-Porenfilter. Frieren Sie die Brühe des Mediums in 100 oder 400 Milliliter Aliquots ein. Bei Stämmen mit rückfälligem Fieber fügen Sie 100 Milliliter 7%ige sterile Gelatine zu 400 Millilitern BSK-II-Medium hinzu.Desinfizieren Sie die Oberfläche und alle Materialien mit 7%Ethanol und übergeben Sie diese sofort in die biologische Sicherheitswerkbank. UV-sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Materialien fünf Minuten vor Beginn der Arbeit. Um eine Kultur zu starten, wärmen Sie das Medium in einem Inkubator vor.Dann einen Milliliter aufgetaute Borrelienkultur aus einer Glycerinbrühe auf fünf bis 15 Milliliter vorgewärmtes BSK-Medium geben. Füllen Sie die Röhrchen fast vollständig, um eine mikro- oder anaerobe Atmosphäre zu schaffen, bevor Sie sie schließen. Züchten Sie Rückfallfieber-Arten bei 37 Grad Celsius und Borrelia burgdorferi sensu lato-Arten bei 33 bis 34 Grad Celsius.Überwachen Sie das Wachstum der Borrelienkultur mit Hilfe von Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie bei 200- bis 400-facher Vergrößerung. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie die Kultur mit einer serologischen Pipette oder verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Transferpipette, während Sie auf und ab pipettieren. Dann auf jeder Seite eines Hämozytometers zum Zählen in 10-Mikroliter-Kulturaliquot laden.Als nächstes verdünnen Sie die Exponentialphasen-Borrelienkultur im Verhältnis eins zu zwei oder eins zu vier mit einem Medium in einem 1,7-Milliliter-Röhrchen. Berücksichtigen Sie bei der Bestimmung der Zellzahl den Verdünnungsfaktor entsprechend. Besprühen Sie die Oberflächen und das Hämozytometer nach Gebrauch mit 10 % verdünntem Bleichmittel und/oder 70 % Ethanol.Für die Extraktion von DNA oder die Isolierung von Borrelienzellen wird die Exponentialphasenkultur 10 Minuten lang bei 4.000 G zentrifugiert und der Überstand in einem geeigneten biologisch gefährlichen Abfall entsorgt. Verarbeiten Sie die pelletierten Bakterien mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit oder resuspendieren Sie sie in einem geeigneten Medium für das beabsichtigte Experiment. Sterilisieren Sie am Ende jedes Experiments alle Geräte mit Ethanol und UV-Strahlung.Sammeln Sie die flüssigen Abfälle, einschließlich der überschüssigen Kultur, in einer Abfallflasche und fügen Sie 10 % Bleichmittel hinzu. Stellen Sie die Flasche auf 80 Grad Celsius, bevor Sie sie entsorgen. Für die Langzeitlagerung von Borrelienkulturen entnehmen Sie das gewünschte Volumen einer Exponentialphasenkultur bei 10 bis 100 Millionen Zellen pro Milliliter, fügen Sie 10 % steriles Glycerin hinzu und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren.Übertragen Sie 1,5 Milliliter Aliquots der Mischung in zwei Milliliter kryogene Fläschchen mit Schraubverschluss. Lagern Sie die Vorratsfläschchen bei 80 Grad Celsius. Halten Sie einen Vorrat mit mindestens 10 Tuben jeder Sorte im Gefrierschrank. Um Borrelien von harten Zecken zu kultivieren, sammeln Sie erwachsene Weibchen, Männchen und Nymphenzecken.Sterilisieren Sie Zecken an der Oberfläche, indem Sie sie zwei Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen und in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen lassen. Anschließend werden die Zecken einzeln mit einem sterilen Skalpell in mehrere Stücke zerlegt. Geben Sie die Stücke dann in zwei Milliliter Röhrchen, die 1,5 Milliliter des mit Antibiotika angereicherten Mediums enthalten.Inkubieren Sie die Kulturen bei 34 Grad Celsius und überprüfen Sie die ersten zwei Wochen zweimal wöchentlich und danach sechs Wochen lang zweimal wöchentlich mit Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie auf Spirochäten. Um Borrelien aus Blutproben zu kultivieren, entfernen Sie das Plasma vorsichtig aus dem Röhrchen und beimpfen Sie einen Milliliter Plasma in fünf Milliliter vorgewärmtes, modifiziertes Kelly-Pettenkofer- oder MKP-Complete-Medium. Für die Kultivierung von Borrelien aus einer Hautbiopsie sterilisieren Sie die Hautbiopsie oberflächlich mit 70%igem Ethanol und Wasserstoffperoxid.Anschließend wird die Biopsieprobe in physiologische Kochsalzlösung gelegt. Würfeln Sie die Probe mit einer sterilen Rasierklinge in einer Glas-Petrischale in zwei bis sechs kleinere Stücke, während Sie sie in die physiologische Kochsalzlösung eintauchen. Die gewürfelte Probe und ein Milliliter Kochsalzlösung, in der die Hautbiopsie aufbewahrt wurde, werden in fünf Milliliter vorgewärmtes Medium mit Antibiotika überführt und bei 33 Grad Celsius inkubiert.Für die Herstellung von Tellern erwärmen Sie 300 Milliliter 1,5x BSK oder MKP Complete Medium ohne Gelatine. Auch 200 Milliliter 1,7%Agarose auf 55 Grad Celsius erwärmen. Mischen Sie die Flüssigkeiten und pipettieren Sie jeweils 15 Milliliter auf 16 tiefe Petrischalen zur unteren Agarschicht.Bewahren Sie den Rest des Mediums in einem Wasserbad auf. Quantifizieren Sie die Dichte der Borrelienkultur und verdünnen Sie sie in einem flüssigen Medium auf die gewünschte Dichte. Nachdem die Bodenplatten erstarrt sind, geben Sie 10 Milliliter der restlichen Agar-Mischung als oberen Agar in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Spirochäten.Gießen Sie die Suspension auf die untere Agarplatte in die beschriftete Petrischale. Nachdem die Platten erstarrt sind, verschließen Sie sie und legen Sie sie kopfüber bei 34 bis 35 Grad Celsius in 2,5 % Kohlendioxid. Bei richtiger Zubereitung erschien das BSK-Medium rot-orange und klar.Zum Vergleich ist hier auch das ungeimpfte MKP-Medium dargestellt. Die Überwucherung durch konkurrierende Bakterien führt zu Trübungen und verklumpten Materialien im Medium. Das Bakterienwachstum wurde mittels visueller Inspektion mittels Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie überwacht.In der exponentiellen Phase sind Borrelienzellen typischerweise schlank, geknickt und bis zu einem gewissen Grad modal. Wenn die Kulturen in der stationären Phase eintreten, werden runde Körper immer deutlicher. Borrelienzellen sind anspruchsvoll und jede Spezies, jeder Stamm und sogar jedes Isolat unterscheidet sich sowohl genetisch als auch durch Anpassung an den Wirt, von dem sie isoliert wurden.Bei der Herstellung von Nährmedien machen geeignete Zutaten einen enormen Unterschied in der Vitalität der Borrelienkultur oder sogar in der Lebensfähigkeit der Kultur. Borrelien-Spirochäten sind eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich. Die Kultur im Labor ist das Sprungbrett für die Erforschung der Biologie dieser Bakterien.Die Kultur liefert das Material, um das Genom, das Proteom, die Evolution und die Interaktionen der Borrelienarten mit den Wirtserregern zu verstehen. Die Borrelienkultur kann mehrere Wochen dauern, bis Spirochäten ausreichend vorhanden sind, um nachgewiesen zu werden. Dies schränkt Diagnoseanwendungen ein.Aber die Kultur kann zeigen, ob Borrelienarten vorhanden, lebensfähig und sich vermehren, und sie kann den Zugang zu Behandlungen erleichtern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

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Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

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Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

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Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

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Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

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