Name: cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00
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この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会とカナダライム病財団(ABおよびVL)、スウェーデン研究評議会(SB、M-LF、IN)、TAČR GAMA 2プロジェクト-「生物学センターCASでのアプリケーションポテンシャル検証2.0のサポート」(TP01010022)(MGおよびNR)、およびチェコ共和国保健省NV19-05-00191(MGおよびNR)からの助成金によって部分的にサポートされました。図4の画像についてはS. Vranjes(2021、Rudenkoラボ)に、図5の画像についてはJ. Thomas-Ebbett(2021、ロイドラボ)に感謝します。この分野に貢献したすべての研究者に感謝し、スペースの制限のために引用できなかった研究者に謝罪します。

ヒト被験者から得られたサンプルを含むすべての研究は、関連する大学および/または医療施設の治験審査委員会によって承認され、サンプルが収集される前に参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。動物から得られたサンプルを含むすべての研究は、施設動物倫理委員会のガイドラインの下で承認され、実施されました。必要に応じて、環境サンプリングの承認が...

細菌の実験室培養は研究の出発点です。培養能力によってもたらされる大きな利点は、梅毒の病因であるスピロヘータであるトレポネーマパリダムを培養するために、ごく最近成功に至った1世紀以上にわたる闘争によって例示されます44。ボレリア・スピロヘータも培養に挑戦的であるが、培養は可能である23、24、<...

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループ、再発熱(RF)グループ、および爬虫類に限定されているように見えるあまり特徴のないグループの3つの主要なクレードを含むスピロヘータ細菌の属です。ボレリア分類学は、他のほとんどの分類群1,2,3,4,5,6,7と同様に、ゲノムとプロテオームの比較を可能にする分子方法論の出現により流動的である。LBグループ(ライム病グループとも呼ばれます)は、伝統的に、その最も特徴的なメンバーであるボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトにちなんでボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトと呼ばれています。この論文では、現在最も広く使用されている用語であるLB、RF、および爬虫類関連グループを使用し、LBおよびRFグループの培養プロトコルについて説明します。
スピロヘタ科のメンバーに期待されるように、ボレリアは、典型的には長さ20〜30μm、幅0.2〜0.3μmの独特の長くて細いらせん形状を採用することができる。しかし、ボレリア細胞は非常に多形性であり、それらの複雑な細胞および遺伝子構造の結果として、培養およびin vivoの両方で他の多くの形状を採用することができます1,8。そのスピロヘータ形態では、平面正弦波形態は、内膜と外膜の間のペリプラズム空間で回転する軸方向の鞭毛藻に起因します。この構造は、細胞が宿主組織と相互作用することを可能にするタンパク質を含む外膜を有する、細胞を高度に運動させることを可能にする9,10。外膜タンパク質の発現は厳密に調節されており、宿主組織への浸潤だけでなく、宿主免疫系との相互作用にも影響を及ぼす11。この複雑な遺伝子発現により、ボレリア細胞は脊椎動物宿主と無脊椎動物ベクターの非常に異なる環境の間を行き来することができます。ボレリアのゲノムは原核生物の間では珍しく、環状染色体ではなく線状染色体で構成されています。直鎖染色体に加えて、ボレリア種は7〜21個のプラスミドを含み、いくつかは線状およびいくつかは環状である。プラスミドは宿主の適応と病原性に必要な遺伝子の大部分を保持しており、プロファージに由来する環状プラスミドは、スピロヘータ細胞間の水平遺伝子流動の大部分を担っていると考えられています12,13。宿主適応における役割と一致して、ライムボレリア症群の一部、おそらく多くまたはすべてのメンバーは、培養においてプラスミドを失う14。B. burgdorferiの最も研究されている「実験室適応」株であるB31は、この種の野生分離株に見られる9つのプラスミドのうち7つだけを持っています15。同様に、B. gariniiは培養16でプラスミドを失います。いくつかの研究では、RF種とB. miyamotoiが培養時にプラスミドを保持することが示されています14,17が、最近の研究では、長期間のin vitro培養でプラスミドと感染力が変化していることが示されています18。
培養ベースの方法は、研究と臨床研究の両方において、細菌感染症の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています14,17。体液または組織からの病原体の培養は、複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供します14,17。このプロトコルは、LBグループ、RFボレリアおよびB.miyamotoiのスピロヘータをうまく培養するために必要な方法論とレシピを示しています。ボレリア・スピロヘータを増殖させるための基本的な培地は、汚染された原核生物の増殖を減少させるための抗生物質の有無にかかわらず、バーバー・ストーナー・ケリー培地(BSK-IIまたは市販のBSK-H)である。この培地は、もともとRFボレリア19をサポートするために使用されていた培地から適応され、Stoenner20によってさらに変更され、次にBarbour21によって修正されました。それ以来、多くの改変が開発されており、それぞれが細菌生理機能に影響を及ぼし、成長、感染力、および病原性に影響を与える可能性があります22。この培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実に支持し、ダニ、哺乳類、および臨床サンプルからスピロヘータを単離するために使用されています23。より最近開発されたバリエーションである修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地は、培養物の播種に利用可能なサンプル中に存在するスピロヘータの数が少ない場合に、環境サンプルから新しいボレリア分離株を単離する際に、より良い単離成功、形態、および運動性を提供できます23,24。すべての場合において、栽培の成功は、新たに調製された培地と適切な成分の使用に大きく依存しています。すべての市販の原料が高品質の培地を生産するわけではありません。接種培養物は、少量の残留周囲酸素の存在下で、従来の32〜34°Cのインキュベーター内で振とうすることなく便利にインキュベートすることができる。ボレリア・スピロヘータは嫌気性菌ですが、自然界では酸素と二酸化炭素の濃度の変動にさらされ、遺伝子発現の変化に応答します26,27,28,29。したがって、遺伝子発現、成長、およびその他の代謝研究は、酸素制御インキュベーターまたは嫌気性チャンバーを使用して酸素および二酸化炭素レベルを制御する必要があります。培養では、培養物は毎週、またはより頻繁に、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡のいずれかでスピロヘータの存在についてチェックされます。培養塗抹標本は、銀染色、免疫組織化学、または蛍光タグ付き株29、30のいずれかで染色することができる。PCRとそれに続くDNAシーケンシングは、ボレリア種を検出し、遺伝的に同定または確認するための高感度で特異的な方法です30、31、32、33。
BSK-IIには多くのマイナーなバリエーションが存在し、一部は市販されています。セクション1でここで説明されているプロトコルは、Barbour (1984)21から適応されています。液体MKP培地は、より最近開発された培地であり、セクション2に記載されている。これは、以前に報告されたプロトコル33,34に従って調製され、BSK培地と同様に、基本培地の調製および完全培地の調製の2つの工程からなる。ボレリア培養培地は、セクション3に記載されているように、抗生物質の有無にかかわらず調製できます。抗生物質は、セクション4で説明されているように、臨床サンプルまたは環境サンプルを接種するときに導入される汚染細菌を減らすように機能します。純粋なボレリアsp.培養物を接種する場合、抗生物質は必要ないかもしれません。ボレリアの長期株を作ることはしばしば重要であり、そのためのプロトコルはセクション5で説明されています。セクション6では、これらの培地を使用して、臨床サンプルまたは環境サンプルから純粋なボレリアセンスラトクローンを単離する方法について説明します。可能なアプローチはいくつかあります36。以下は効果的であることが判明したものです。このプロトコルで使用されるプレーティング媒体は、BSK-IIメッキ培地37およびMKP培地34の改変です(ウサギ血清を10%38に増加)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#160;&#181;m Sterile syringe filter&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT10XLS3</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229011B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>188261</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309661</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT200</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Screw Cap Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933C</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipettes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229025B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Sterile syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7409</td>
			<td>Source is important - see note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229006B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229421</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 ml MKP glass tubes&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Nr. 26 135 115</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1654</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Brucella broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>211088</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>302419100</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (yellow top - ACD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD&#160;Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]&#160;</td>
			<td>Darlynn biologicals</td>
			<td>BB83-500</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model 5430</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid TrisodiumSaltDihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8532 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>21540 500 mL</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-510-018</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Tubes (Nalgene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Petri with stacking ring 100 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7741</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model 1545</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for filter sterilization</td>
			<td>Millipore 0.22&#956;m GPExpressPLUS Membrane</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco BD</td>
			<td>214340 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>99449-20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021 1 kg</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemafuge (Hematocrit &#38; Immuno hematology centrifuge )</td>
			<td>Labwissen</td>
			<td>Model 3220</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H-3784 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucoseamine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A-3286 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neopeptone</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>211681 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hematocytometer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope&#160;</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Standard Balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>model TS200S</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8574 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16-120-032</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-4505&#160; 100 mL</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761&#160;&#160;&#160;&#160; 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufametaxazole&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Yeastolate</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>255752 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-044</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1056</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループの3つの種グループで構成され、B.ブルグドルフェリセンスラト(s.l.)としても知られ、最近ボレリエラ、再発熱(RF)グループボレリア、およびスピロヘータの3番目の爬虫類関連グループに再分類されました。体液または組織からの病原体の培養が複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供するため、培養ベースの方法は、研究と臨床作業の両方で細菌感染の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています。ボレリアとボレリエラ・スピロヘータは潔癖で成長が遅いため、一般的に臨床目的で培養されていません。 しかし、研究には文化が必要です。このプロトコルは、B. afzelii、B. americana、B. andersonii、B. bavariensis、B. bissettii/bissettiae、B. burgdorferi sensu stricto(s.s)、B. californiensis、B. carolinensis、B. chilensis、B. finlandensis、B. garinii、B. japonica、B. kurtenbachii、B. lanei、 B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, B. miyamotoi.LBおよびRFスピロヘータを成長させるための基本的な培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実にサポートするバーバー・ストーナー・ケリー(BSK-IIまたはBSK-H)培地です。接種材料中で初期スピロヘータ数が低いダニまたは宿主由来のサンプルから新たに単離されたボレリア分離株を増殖させることができるように、修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地が好ましい。この培地は、B. miyamotoiの増殖もサポートします。RFスピロヘータの栽培の成功は、成分の品質にも大きく依存します。

ボレリア 培地BSKおよびMKP、およびバリアントは、順次調製および滅菌する必要がある成分を含む豊富な培地です。正しく調製されると、BSK培地は赤橙色で透明になります(図1)。加温後も持続する濁度と沈殿は、問題のある成分、中程度の生産、または汚染を示しています。そのような培地は捨てるのが一番です。ゼラチンをBSKおよびMKPに添加すると、冷蔵すると...

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Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

体外培養は、生菌の存在を直接検出する方法です。このプロトコルは、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体、再発熱ボレリア種、およびボレリア・ミヤモトイのものを含む、多様なボレリア・スピロヘータの培養方法について説明しています。これらの種は潔癖で成長が遅いですが、培養することができます。

ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト・コンプレックスと再発熱ボレリアからのスピロヘータの栽培方法

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

ボレリアは、3つの主要な種類を含むスピロヘータ細菌の属です。ライムボレリア症グループ、再発熱グループ、および爬虫類に見られるあまり特徴のないグループ。多くのボレリア種は病原性です。細菌の培養は感染を検出するためのゴールドスタンダードです。これは、研究と臨床研究の両方に当てはまります。体液および組織からの細菌の培養は、細菌が生存可能であり、複製可能であることを確認する。このプロトコルは、ライムボレリア症グループのスピロヘータ、再発発熱ボレリア、およびボレリアミヤモトイの培養と保存を成功させるために必要な方法論とレシピを示しています。以前に単離された種および株、ならびに環境または哺乳類の供給源からの新しい分離株およびモノクローナル単離物の培養のための方法が提供される。手順を実演するのは、ポスドク研究員のマリーラインフォーシリオン、バーグストロム研究所の技術者であるインゲラニルソン、ロイド研究所の研究員であるアンベルトルド、ルデンコ研究所の研究員であるマリナゴロフチェンコです。まず、1リットルのバーバラ・ストーナー・ケリー培地またはBSK-II培地を調製するために必要な試薬を入手します。水をかき混ぜてBSAをビーカーに溶かすことから始めます。次に、すべての乾燥化学物質を追加し、CMRLを追加する前にそれらを溶解させます。培地のpHを7.6に調整します。必要に応じて、1モルの水酸化ナトリウムを使用してください。次に、ウサギ血清を培地に6〜10%の濃度で加えます細菌の増殖が強くない場合は、さらに2%血清を培地に追加します。次に、0.22ミクロンのポアフィルターを使用して培地を滅菌します。培地のストックを100または400ミリリットルのアリコートで凍結します。再発熱株の場合は、100ミリリットルの7%滅菌ゼラチンを400ミリリットルのBSK-II培地に加えます。表面とすべての材料を7%エタノールで消毒し、すぐに生物学的安全キャビネットに移します。作業開始前の5分間、すべての非生物学的材料をUV滅菌します。培養を開始するには、インキュベーター内で培地を予熱します。次に、グリセロールストックから1ミリリットルの解凍ボレリア培養物を5〜15ミリリットルの予熱したBSK培地に加えます。チューブを閉じる前に、チューブをほぼ完全に満たして、微または嫌気性雰囲気を作ります。摂氏37度で再発熱種を、摂氏33〜34度でボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト種を育てます。位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡を使用して、200〜400倍の倍率でボレリア培養の成長を監視します。細胞の均一な分布を確保するには、培養液を血清学的ピペットと混合するか、3ミリリットルのトランスファーピペットを使用して上下にピペッティングします。次に、カウントのために血球計算盤の両側に10マイクロリットルの培養アリコートをロードします。次に、指数相ボレリア培養物を1.7ミリリットルチューブ中の培地で1対2または1対4の比率で希釈する。細胞数を決定する際には、希釈係数を適切に考慮してください。使用後は、表面と血球計算盤に10%希釈漂白剤および/または70%エタノールをスプレーします。DNAの抽出またはボレリア細胞の単離のために、指数相培養を4, 000Gで10分間遠心分離し、適切なバイオハザード廃棄物に上清を廃棄する。ペレット化した細菌を市販のDNA抽出キットで処理するか、目的の実験に適した培地に再懸濁します。各実験の最後に、すべての機器をエタノールと紫外線で滅菌します。余分な培養液を含む廃液を廃液ボトルに集め、10%漂白剤を加えます。ボトルを摂氏80度に置いてから廃棄してください。ボレリア培養物を長期保存する場合は、ミリリットルあたり1,000万〜1億細胞で指数相培養の希望量を採取し、10%滅菌グリセロールを添加し、上下にピペッティングして混合します。混合物の1.5ミリリットルアリコートを2ミリリットルのスクリューキャップ極低温バイアルに移します。ストックバイアルは摂氏80度で保管してください。冷凍庫に各株の少なくとも10本のチューブで在庫を維持し、硬いダニからボレリアを栽培するには、成体の雌、雄、および幼虫のダニを収集します。ダニを70%エタノールに2分間浸して表面滅菌し、バイオセーフティキャビネットで風乾します。次に、滅菌メスを使用してダニを個別にいくつかの部分に解剖します。次に、抗生物質を添加した1.5ミリリットルの培地を含む2ミリリットルのチューブに小片を入れます。培養液を摂氏34度でインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡でスピロヘータを最初の2週間は週に2回、その後は6週間毎週確認します。血液サンプルからボレリアを培養するには、チューブから血漿を静かに取り出し、1ミリリットルの血漿を5ミリリットルの予熱された変性ケリーペッテンコーファーまたはMKP完全培地に接種します。皮膚生検からのボレリアの培養のために、70%エタノールおよび過酸化水素で皮膚生検を表面滅菌する。次に、生検サンプルを生理食塩水に入れます。生理食塩水に浸しながら、ガラスシャーレに滅菌かみそりの刃を使用してサンプルを2〜6個の小さな断片にさいの目に切る。さいの目に切ったサンプルと皮膚生検を保存した1ミリリットルの生理食塩水を、抗生物質を添加した5ミリリットルの予熱培地に移し、摂氏33度でインキュベートします。プレートを作るには、ゼラチンを含まない300ミリリットルの1.5x BSKまたはMKP完全培地を温めます。また、200ミリリットルの1.7%アガロースを摂氏55度に温めます。液体とピペットをそれぞれ15ミリリットルずつ16枚の深いペトリ皿に混ぜて、底寒天層を作ります。残りの培地を水浴に維持する。ボレリア培養密度を定量化し、液体培地中で所望の密度に希釈します。底板が固まったら、残りの寒天混合物を上寒天として10ミリリットル、適当な数のスピロヘータを入れた15ミリリットルのチューブに加える。懸濁液を底寒天プレートにラベルを付けたペトリ皿に注ぎます。プレートが固まったら閉じて、34%二酸化炭素に摂氏35〜2.5度で逆さまに置きます。正しく調製すると、BSK培地は赤橙色で透明に見えました。比較のため、MKP未接種培地もここに示されている。競合する細菌による異常増殖は、培地中に濁りと凝集した物質を生成します。細菌の増殖は、位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡による目視検査によってモニターした。指数関数的段階では、ボレリア細胞は通常、細く、ねじれており、ある程度モーダルです。培養物が静止期に入るにつれて、丸い体はますます明白になります。ボレリア細胞は潔癖であり、それぞれの種および株および単離物でさえ、遺伝的にも、それらが単離された宿主への適応によっても異なる。培地を作るとき、適切な成分はボレリア文化の活力、あるいは文化の実行可能性さえも大きな違いをもたらします。ボレリア・スピロヘータは培養に挑戦的ですが、培養は可能です。実験室での培養は、これらの細菌の生物学に関する研究の出発点です。培養は、ボレリア種のゲノム、プロテオーム、進化、および宿主病原体の相互作用を理解するための材料を提供します。ボレリア培養は、スピロヘータが検出のために十分に豊富になるまでに数週間かかることがあります。これにより、診断アプリケーションが制限されます。しかし、文化はボレリア種が存在し、生存し、複製されているかどうかを示すことができ、治療にアクセスするのに役立ちます。

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Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

セルカリア変換と in vitroで</emの>栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

の栽培<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus：</em&gt;免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

ボレリエラ(ボレリア)ブルグドルフェリの必須成分 in vitro転写アッセイ

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...