Name: cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia at JoVE.com

이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회와 캐나다 라임병 재단(AB 및 VL), 스웨덴 연구 위원회(SB, M-LF 및 IN), TAČR GAMA 2 프로젝트 - "생물학 센터 CAS에서 응용 가능성 검증 2.0 지원"(TP01010022)(MG 및 NR) 및 체코 보건부 NV19-05-00191(MG 및 NR)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 4의 이미지에 대해 S. Vranjes(2021, Rudenko lab)에게, 그림 5의 이미지에 대해 J. Thomas-Ebbett(2021, Lloyd lab)에게 감사드립니다. 이 분야에 기여한 모든 연구자들에게 감사드리며, 지면의 제약으로 인해 인용하지 못한 분들께 사과드립니다.

인간 피험자로부터 얻은 샘플과 관련된 모든 연구는 관련 대학 및/또는 의료 시설의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 샘플을 수집하기 전에 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 동물에서 채취한 샘플과 관련된 모든 연구는 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 해당되는 경우 환경 샘플링에 대한 승인을 받았습니다.
참고: 문화의 성공은 ?...

박테리아의 실험실 배양은 연구의 발판입니다. 배양 능력에 의해 부여되는 심오한 이점은 매독의 병인인 스피로헤타인 Treponema pallidum을 배양하기 위한100년 이상의 투쟁에서 예시됩니다 44. Borrelia spirochetes도 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s...

Borrelia는 라임 보렐리오스(LB) 그룹, 재발열(RF) 그룹 및 파충류에 국한된 것처럼 보이는 덜 잘 특성화된 그룹의 세 가지 주요 분기군을 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. Borrelia 분류학은 대부분의 다른 분류학적 그룹 1,2,3,4,5,6,7과 마찬가지로 게놈과 프로테옴 비교를 허용하는 분자 방법론의 출현과 함께 유동적입니다. LB 그룹(라임병 그룹이라고도 함)은 전통적으로 가장 특징적인 구성원인 Borrelia burgdorferi sensu stricto의 이름을 따서 Borrelia burgdorferi sensu lato라고 불렸습니다.  이 논문은 현재 가장 널리 사용되는 용어인 LB, RF 및 파충류 관련 그룹을 사용하고 LB 및 RF 그룹에 대한 배양 프로토콜을 설명합니다.
Spirochaetaceae 계통의 구성원에게 예상되는 바와 같이 Borrelia는 일반적으로 길이 20-30 μm, 너비 0.2-0.3 μm의 독특하고 길고 얇은 나선형 모양을 채택 할 수 있습니다. 그러나 Borrelia 세포는 매우 다형성이며 복잡한 세포 및 유전 구조의 결과로 배양 및 생체 내 1,8 모두에서 다른 많은 모양을 채택할 수 있습니다. 스피로헤탈 형태에서 평면 사인파 형태는 내막과 외막 사이의 주변세포질 공간에서 회전하는 축 방향 내편모충의 결과입니다. 이 구조는 세포가 숙주 조직과 상호 작용할 수 있도록 하는 단백질을 포함하는 외막과 함께 세포가 매우 운동성을 가질 수 있도록 합니다 9,10. 외막 단백질의 발현은 엄격하게 조절되며 숙주 조직 침습뿐만 아니라 숙주 면역계와의 상호 작용에도 영향을 미친다11. 이 복잡한 유전자 발현은 Borrelia 세포가 척추동물 숙주와 무척추동물 벡터의 매우 다른 환경 사이를 왕복할 수 있도록 합니다. Borrelia의 게놈은 원형 염색체가 아닌 선형 염색체로 구성된 원핵 생물 중에서 드뭅니다. 선형 염색체 외에도 Borrelia 종에는 7-21 개의 플라스미드가 포함되어 있으며 일부는 선형이고 일부는 원형입니다. 플라스미드는 숙주 적응 및 독성에 필요한 대부분의 유전자를 보유하고 있으며, 프로파지에서 유래한 원형 플라스미드는 스피로헤탈 세포 사이의 수평 유전자 흐름의 대부분을 담당하는 것으로 생각됩니다12,13. 숙주 적응에서의 역할과 일관되게, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis) 그룹의 일부, 아마도 많은 구성원 또는 전부가 배양에서 플라스미드를 잃는다14. 가장 잘 연구된 B. burgdorferi, B31의 "실험실 적응" 균주는 이 종의 야생 분리주에서 발견되는 9개의 플라스미드 중 7개만 가지고 있다15. 유사하게, B. garinii는 배양물16에서 플라스미드를 잃는다. 일부 연구에서는 RF종과 B. miyamotoi가 배양 시 플라스미드를 보유하는 것으로 나타났으나 14,17, 최근 연구에서는 장기간 체외 배양을 통해 플라스미드와 감염성이 변화된 것으로 나타났다18.
배양 기반 방법은 연구 및 임상 작업 모두에서 박테리아 감염의 실험실 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다14,17. 체액 또는 조직에서 병원체의 배양은 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를위한 소스 자료를 제공합니다14,17. 이 프로토콜은 LB 그룹과 RF Borrelia 및 B. miyamotoi의 스피로헤타를 성공적으로 배양하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. Borrelia spirochetes를 재배하기 위한 기본 배지는 오염된 원핵생물의 성장을 줄이기 위해 항생제를 사용하거나 사용하지 않는 Barbour-Stoenner-Kelly 배지(BSK-II 또는 상업적으로 이용 가능한 BSK-H)입니다. 이 매체는 원래 RF Borrelia19를 지원하는 데 사용된 매체에서 채택되었으며 Stoenner20과 Barbour21에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로 많은 변형이 개발되었으며, 각각은 성장, 감염성 및 병원성에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 생리학에 영향을 미친다22. 이 배지는 확립된 배양균에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원하며, 진드기, 포유류, 임상 검체에서 스피로헤타를 분리하는 데 사용되어 왔다23. 보다 최근에 개발된 변형인 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지는 배양에 사용할 수 있는 샘플에 존재하는 스피로헤타의 수가23,24개 낮을 때 환경 샘플에서 새로운 Borrelia 분리주를 분리할 때 더 나은 분리 성공, 형태 및 운동성을 제공할 수 있습니다. 모든 경우에 재배의 성공 여부는 신선하게 준비된 배지와 적절한 재료의 사용에 크게 좌우됩니다. 모든 상업용 성분이 고품질 매체를 생산하는 것은 아닙니다. 접종된 배양물은 소량의 잔류 주변 산소의 존재 하에 통상적인 32-34°C 인큐베이터에서 진탕 없이 편리하게 인큐베이션될 수 있다. Borrelia spirochetes는 혐기성 세균이지만 본질적으로 산소 및 이산화탄소 농도의 변동에 노출되며 유전자 발현의 변화에 반응합니다26,27,28,29. 따라서 유전자 발현, 성장 및 기타 대사 연구는 산소 제어 인큐베이터 또는 혐기성 챔버를 사용하여 산소 및 이산화탄소 수준을 제어해야 합니다. 배양에서 배양은 암시야 현미경 또는 위상차 현미경을 사용하여 스피로헤타의 존재 여부를 매주 또는 더 자주 확인합니다. 배양 도말은 은 염색, 면역조직화학, 또는 형광 태그가 부착된 균주29,30을 사용하여 염색할 수 있습니다. PCR 후 DNA 시퀀싱은 Borrelia 종30,31,32,33을 검출하고 유전적으로 식별하거나 확인하는 민감하고 특이적인 방법입니다.
BSK-II에는 많은 사소한 변형이 존재하며 일부는 상업적으로 이용 가능합니다. 섹션 1에서 여기에 설명된 프로토콜은 Barbour(1984)21에서 채택되었습니다. 액체 MKP 배지는 보다 최근에 개발된 배지이며 섹션 2에 설명되어 있습니다. 이전에보고 된 프로토콜33,34에 따라 제조되며, BSK 배지와 유사하게 기본 배지 준비 및 완전 배지 준비의 두 단계로 구성됩니다. Borrelia 배양 배지는 섹션 3에 설명된 바와 같이 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있습니다. 항생제는 섹션 4에 설명된 대로 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 유입되는 오염 박테리아를 줄이는 역할을 합니다. 순수한 Borrelia sp. 배양액으로 접종하는 경우 항생제가 필요하지 않을 수 있습니다. 장기 Borrelia 주식을 만드는 것은 종종 중요하며 이를 위한 프로토콜은 섹션 5에 설명되어 있습니다. 섹션 6은 이러한 배지를 사용하여 임상 또는 환경 샘플에서 순수한 Borrelia sensu lato 클론을 분리하는 방법을 설명합니다. 가능한 여러 가지 접근법이 있습니다36; 아래는 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 사용된 도금 매체는 BSK-II 도금 매체37 및 MKP 배지 34(토끼 혈청이 10%38로 증가)의 변형입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#160;&#181;m Sterile syringe filter&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT10XLS3</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229011B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>188261</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309661</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT200</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Screw Cap Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933C</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipettes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229025B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Sterile syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7409</td>
			<td>Source is important - see note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229006B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229421</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 ml MKP glass tubes&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Nr. 26 135 115</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1654</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Brucella broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>211088</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>302419100</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (yellow top - ACD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD&#160;Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]&#160;</td>
			<td>Darlynn biologicals</td>
			<td>BB83-500</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model 5430</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid TrisodiumSaltDihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8532 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>21540 500 mL</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-510-018</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Tubes (Nalgene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Petri with stacking ring 100 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7741</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model 1545</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for filter sterilization</td>
			<td>Millipore 0.22&#956;m GPExpressPLUS Membrane</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco BD</td>
			<td>214340 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>99449-20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021 1 kg</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemafuge (Hematocrit &#38; Immuno hematology centrifuge )</td>
			<td>Labwissen</td>
			<td>Model 3220</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H-3784 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucoseamine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A-3286 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neopeptone</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>211681 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hematocytometer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope&#160;</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Standard Balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>model TS200S</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8574 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16-120-032</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-4505&#160; 100 mL</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761&#160;&#160;&#160;&#160; 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufametaxazole&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Yeastolate</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>255752 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-044</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1056</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia

Borrelia는 B. burgdorferi sensu lato (sl)라고도 알려진 라임 보렐리 아증 (LB) 그룹의 세 그룹으로 구성되며 최근에는 Borreliella, 재발 열 (RF) 그룹 Borrelia 및 세 번째 파충류 관련 스피로 체타 그룹으로 재 분류되었습니다. 배양 기반 방법은 체액 또는 조직에서 병원체를 배양하여 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를 위한 소스 자료를 제공하기 때문에 연구 및 임상 작업 모두에서 실험실 박테리아 감염 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. Borrelia와 Borreliella spirochetes는 까다롭고 느리게 자라기 때문에 일반적으로 임상 목적으로 배양되지 않습니다. 그러나 연구에는 문화가 필요합니다. 이 프로토콜은 B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis 및 RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis 및 B. miyamotoi. LB 및 RF 스피로헤타를 성장시키기 위한 기본 배지는 Barbour-Stoenner-Kelly(BSK-II 또는 BSK-H) 배지로, 기존 배양에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원합니다. 접종물에서 초기 스피로헤타 수가 적은 진드기 또는 숙주 유래 샘플에서 새로 분리된 Borrelia 분리물을 성장시킬 수 있으려면 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지가 선호됩니다. 이 배지는 또한 B. miyamotoi 의 성장을 지원합니다.RF 스피로헤타 재배의 성공 여부는 성분의 품질에 크게 좌우됩니다.

Borrelia 배양 배지 BSK 및 MKP 및 변종은 순차적으로 준비하고 멸균해야 하는 성분이 포함된 풍부한 배양 배지입니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 빨간색-주황색이고 투명해야 합니다(그림 1). 온난화 후에도 지속되는 탁도와 강수량은 문제가있는 성분, 중간 생산 또는 오염을 나타냅니다. 이러한 매체는 폐기하는 것이 가장 좋습니다. 젤라틴이 BSK와 MKP에 첨가되면 냉장...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia at JoVE.com

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의 배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelia는 세 가지 주요 종류를 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. 라임 보렐리오스 그룹, 재발열 그룹, 파충류에서 발견되는 덜 잘 특성화된 그룹. 많은 Borrelia 종은 병원성입니다.박테리아 배양은 감염 검출을 위한 황금 표준입니다. 이것은 연구와 임상 작업 모두에 해당됩니다. 체액과 조직에서 박테리아를 배양하면 박테리아가 생존 가능하고 복제할 수 있음을 확인할 수 있습니다.이 프로토콜은 스피로헤타, 재발 발열 보렐리아 및 보렐리아 미야모토이의 라임 보렐리오스 그룹을 성공적으로 배양하고 보존하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. 이전에 분리된 종 및 균주의 배양뿐만 아니라 환경 또는 포유류 공급원으로부터 새로운 분리주 및 단클론 분리물을 위한 방법이 제공됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Marie-Line Faucillion과 Bergstrom Lab의 기술자 인 Ingela Nilsson, Lloyd Lab의 연구원 인 Anne Berthold, Rudenko Lab의 연구원 인 Maryna Golovchenko입니다.시작하려면 1리터의 Barbara-Stoner-Kelly 또는 BSK-II 배지를 준비하는 데 필요한 시약을 구하십시오. 물을 저어 비커에 BSA를 녹이는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 모든 건조 화학 물질을 첨가하고 CMRL을 첨가하기 전에 용해시킵니다.배지의 pH를 7.6으로 조정합니다. 필요한 경우 1 몰 수산화 나트륨을 사용하십시오. 다음으로, 6-10%의 농도로 배지에 토끼 혈청을 첨가합니다.박테리아 성장이 강하지 않은 경우 배지에 2% 혈청에 다른 하나를 추가합니다.그런 다음 0.22 미크론 기공 필터를 사용하여 배지를 멸균합니다. 100 또는 400 밀리리터 부분 표본으로 배지의 주식을 동결하십시오. 재발 열 균주의 경우 100 밀리리터의 7 % 멸균 젤라틴을 BSK-II 배지 400 밀리리터에 첨가하십시오.표면과 모든 물질을 7 % 에탄올로 소독하고 즉시 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. UV는 작업 시작 전에 5 분 동안 모든 비 생물학적 물질을 살균합니다. 배양을 시작하려면 인큐베이터에서 배지를 예열하십시오.그런 다음 글리세롤 스톡에서 해동 된 Borrelia 배양 물 1 밀리리터를 예열 된 BSK 배지 5-15 밀리리터에 첨가하십시오. 튜브를 닫기 전에 미세 또는 혐기성 분위기를 만들기 위해 튜브를 거의 완전히 채우십시오. 섭씨 37도에서 재발 발열 종을, 섭씨 33도에서 34도에서 Borrelia burgdorferi sensu lato 종을 재배하십시오.200-400배 배율의 위상차 또는 암시야 현미경을 사용하여 Borrelia 배양액의 성장을 모니터링합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하려면 배양물을 혈청학적 피펫과 혼합하거나 위아래로 피펫팅하면서 3밀리리터 이송 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 계수를 위해 혈구계의 양쪽에 10마이크로리터 배양 분취량을 로드합니다.다음으로, 지수 단계 Borrelia 배양을 1.7 밀리리터 튜브의 배지로 1 대 2 또는 1 대 4의 비율로 희석합니다. 세포 수를 결정할 때 희석 계수를 적절하게 고려하십시오. 사용 후에는 표면과 혈구계에 10% 희석된 표백제 및/또는 70% 에탄올을 뿌립니다.DNA의 추출 또는 Borrelia 세포의 분리를 위해, 4, 000 G에서 10 분 동안 지수 상 배양을 원심 분리하고 적절한 생물학적 위험 폐기물에 상청액을 버린다. 펠렛화된 박테리아를 상업용 DNA 추출 키트로 처리하거나 의도한 실험을 위해 적절한 배지에 재현탁합니다. 각 실험이 끝나면 모든 장비를 에탄올과 자외선으로 멸균하십시오.과잉 배양액을 포함한 액체 폐기물을 쓰레기통에 수거하고 표백제를 10% 첨가합니다. 병을 버리기 전에 섭씨 80도에 두십시오. Borrelia 배양의 장기 보관을 위해 원하는 부피의 지수 단계 배양을 밀리리터당 1,000만에서 1억 개의 세포로 취하고 10% 멸균 글리세롤을 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.혼합물의 1.5 밀리리터 분취량을 2 밀리리터 스크류 캡 극저온 바이알에 옮긴다. 스톡 바이알을 섭씨 80도에서 보관하십시오. 냉동실에 각 균주의 튜브를 10 개 이상 보관하고, 딱딱한 진드기에서 Borrelia를 재배하려면 성인 여성, 남성 및 nymphal 진드기를 수집하십시오.진드기를 70 % 에탄올에 2 분 동안 담그고 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조하여 표면을 살균합니다. 다음으로, 멸균 메스를 사용하여 진드기를 개별적으로 여러 조각으로 해부하십시오. 그런 다음 항생제가 보충 된 1.5 밀리리터의 배지가 들어있는 2 밀리리터 튜브에 조각을 넣습니다.배양액을 섭씨 34도에서 배양하고 암시야 또는 위상차 현미경으로 처음 2주 동안은 매주 2회, 그 후 6주 동안은 매주 스피로헤타를 확인합니다. 혈액 샘플에서 Borrelia를 배양하려면 튜브에서 혈장을 부드럽게 제거하고 1 밀리리터의 혈장을 5 밀리리터의 예열 된 변형 된 Kelly-Pettenkofer 또는 MKP Complete 배지에 접종합니다. 피부 생검에서 Borrelia를 배양하려면 70 % 에탄올과 과산화수소로 피부 생검을 표면 멸균하십시오.그런 다음 생검 샘플을 생리 식염수에 넣습니다. 생리 식염수에 담그는 동안 유리 페트리 접시에 멸균 면도날을 사용하여 샘플을 2-6 개의 작은 조각으로 깍둑 썰기합니다. 깍둑썰기한 샘플과 피부 생검을 보관한 식염수 1밀리리터를 항생제가 보충된 예열 배지 5밀리리터에 옮기고 섭씨 33도에서 배양합니다.접시를 만들기 위해 젤라틴이없는 1.5x BSK 또는 MKP Complete 배지 300 밀리리터를 따뜻하게합니다. 또한 1.7 % 아가로즈 200 밀리리터를 섭씨 55도까지 따뜻하게합니다. 액체와 피펫 15 밀리리터를 각각 16 개의 깊은 페트리 접시에 혼합하여 바닥 한천 층을 만듭니다.나머지 매체는 수조에 보관하십시오. Borrelia 배양 밀도를 정량화하고 액체 배지에서 원하는 밀도로 희석합니다. 바닥 플레이트가 굳은 후, 적절한 수의 스피로헤타가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 상부 한천으로서 10 밀리리터의 남은 한천 혼합물을 첨가한다.하단 한천 플레이트에 현탁액을 라벨이 붙은 페트리 접시에 붓습니다. 플레이트가 굳은 후 닫고 2.5 % 이산화탄소에 섭씨 34도에서 35도까지 거꾸로 놓습니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 적색-주황색으로 투명하게 나타났습니다.비교를 위해, MKP 미접종 배지도 여기에 나타내었다. 경쟁 박테리아에 의한 과증식은 배지에 탁도와 응집된 물질을 생성합니다. 박테리아 성장은 위상차 또는 암시야 현미경에 의한 육안 검사로 모니터링되었습니다.지수 단계에서 Borrelia 세포는 일반적으로 어느 정도 가늘고 꼬여 있으며 모달입니다. 문화가 정지 단계에 들어감에 따라 둥근 몸체가 점점 더 분명해지고 있습니다. Borrelia 세포는 까다롭고 각 종과 균주 및 심지어 분리도 유전적으로 그리고 분리된 숙주에 대한 적응을 통해 다릅니다.배지를 만들 때 적절한 재료는 보렐리아 문화의 활력이나 문화의 생존 가능성에 엄청난 차이를 만듭니다. Borrelia spirochetes는 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다. 실험실에서의 배양은 이러한 박테리아의 생물학 연구의 발판입니다.문화는 Borrelia 종의 게놈, 프로테옴, 진화 및 숙주 병원체 상호 작용을 이해하는 자료를 제공합니다. Borrelia 문화는 스피로헤타가 검출하기에 충분히 풍부해지기까지 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 이는 진단 응용 프로그램을 제한합니다.그러나 문화는 Borrelia 종이 존재하고, 생존 가능하고, 복제되는지 보여줄 수 있으며, 치료에 접근하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

연구

면역학 및 감염병학

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial 변화와 체외에서</em의> 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...