Name: cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kanada Lyme hastalığı Vakfı (AB ve VL), İsveç Araştırma Konseyi (SB, M-LF ve IN), TAČR GAMA 2 projesi - "Biyoloji Merkezi CAS'ta uygulama potansiyeli doğrulama 2.0 desteği" (TP01010022) (MG ve NR) ve Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı NV19-05-00191 (MG ve NR) tarafından desteklenmiştir. Şekil 4'teki görüntü için S. Vranjes'e (2021, Rudenko laboratuvarı) ve Şekil 5'teki görüntüler için J. Thomas-Ebbett'e (2021, Lloyd laboratuvarı) teşekkür ederiz. Alanında emeği geçen tüm araştırmacılara teşekkür ediyor, alan kısıtlılığı nedeniyle çalışmalarına atıf yapamadığımız araştırmacılardan özür diliyoruz.

İnsan deneklerden elde edilen örnekleri içeren tüm çalışmalar, ilgili Üniversite ve/veya tıbbi tesisin Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve örnekler toplanmadan önce katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Hayvanlardan alınan örnekleri içeren tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Etik Kurulu rehberliğinde onaylanmış ve yürütülmüştür. İlgili olduğunda, çevresel örnekleme için onaylar alınmıştır.
NOT: Kültürün başarıs?...

Bakterilerin laboratuvar kültürü, araştırma için sıçrama tahtasıdır. Kültür yeteneğinin sağladığı derin avantaj, bir yüzyıldan fazla bir süredir ancak son zamanlarda başarı ile sonuçlanan, sifilizin etiyolojik ajanı olan Treponema pallidum'un kültürüne verilen mücadeleyle örneklenmektedir44. Borrelia spiroketleri de kültüre meydan okuyor, ancak kültür mümkün 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s...

Borrelia, üç ana kladeyi kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir: Lyme borreliosis (LB) grubu, tekrarlayan ateş (RF) grubu ve görünüşte sürüngenlerle sınırlı olan daha az iyi karakterize edilmiş bir grup. Borrelia taksonomisi, diğer birçok taksonomik grup 1,2,3,4,5,6,7 için geçerli olduğu gibi, genom ve proteom karşılaştırmalarına izin veren moleküler metodolojilerin ortaya çıkmasıyla uyum içindedir. LB grubu (Lyme hastalığı grubu olarak da adlandırılır) geleneksel olarak en iyi karakterize edilen üyesi Borrelia burgdorferi sensu stricto'dan sonra Borrelia burgdorferi sensu lato olarak adlandırılmıştır.  Bu makale şu anda en yaygın kullanılan terminolojiyi kullanmaktadır: LB, RF ve sürüngenle ilişkili grup, LB ve RF grupları için kültür protokollerini açıklamaktadır.
Spirochaetaceae familyasının bir üyesi için beklendiği gibi, Borrelia, tipik olarak 20-30 μm uzunluğunda ve 0.2-0.3 μm genişliğinde, belirgin şekilde uzun ve ince spiral şeklini benimseyebilir. Bununla birlikte, Borrelia hücreleri oldukça pleomorfiktir ve karmaşık hücresel ve genetik yapılarının bir sonucu olarak hem kültürde hem de in vivo 1,8'de birçok başka şekli benimseyebilir. Spiroketal formunda, düzlemsel sinüs dalgası morfolojisi, iç ve dış zarlar arasındaki periplazmik boşlukta dönen eksenel endoflagellasından kaynaklanır. Bu yapı, hücrelerin konakçı dokularla etkileşime girmesini sağlayan proteinler içeren dış zar ile hücrelerin oldukça hareketli olmasını sağlar 9,10. Dış zar proteinlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve sadece konakçı doku invazyonunu değil, aynı zamanda konakçı bağışıklık sistemi ile etkileşimi de etkiler11. Bu karmaşık gen ekspresyonu, Borrelia hücrelerinin omurgalı konakçıların ve omurgasız vektörlerin çok farklı ortamları arasında mekik dokumasına izin verir. Borrelia'nın genomu, dairesel bir kromozomdan ziyade doğrusal bir kromozomdan oluşan prokaryotlar arasında olağandışıdır. Doğrusal kromozoma ek olarak, Borrelia türleri bazıları doğrusal ve bazıları dairesel olmak üzere 7-21 plazmid içerir. Plazmidler, konakçı adaptasyonu ve virülans için gerekli genlerin çoğunu barındırır ve profajlardan türetilen dairesel plazmidlerin, spiroketal hücreler arasındaki yatay gen akışının çoğunluğundan sorumlu olduğu düşünülmektedir12,13. Konakçı adaptasyonundaki rolüyle tutarlı olarak, Lyme borreliosis grubunun bazıları, muhtemelen çoğu veya tümü, kültür14'te plazmidleri kaybeder. B. burgdorferi'nin en iyi çalışılmış "laboratuvara uyarlanmış" suşu olan B31, bu türün vahşi izolatlarında bulunan dokuz plazmidden sadece yedisine sahiptir15. Benzer şekilde, B. garinii kültür16'da plazmidleri kaybeder. Bazı çalışmalar, RF türlerinin ve B. miyamotoi'nin kültürlendiğinde plazmidleri koruduğunu göstermiştir14,17, ancak son çalışmalar uzun süreli in vitro ekim ile değişmiş plazmidleri ve bulaşıcılık göstermektedir 18.
Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespitinde altın standart olmaya devam etmektedir14,17. Vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar14,17. Bu protokol, LB grubunun spiroketlerinin yanı sıra RF Borrelia ve B. miyamotoi'nin spiroşetlerini başarılı bir şekilde kültürlemek için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Borrelia spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, kirletici prokaryotların büyümesini azaltmak için antibiyotikli veya antibiyotiksiz Barbour-Stoenner-Kelly ortamıdır (BSK-II veya ticari olarak temin edilebilen BSK-H). Bu ortam, başlangıçta RF Borrelia19'u desteklemek için kullanılan bir ortamdan uyarlandı, Stoenner20 ve daha sonra Barbour21 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, her biri büyümeyi, bulaşıcılığı ve patojeniteyi etkileyebilecek bakteriyel fizyoloji üzerinde etkileri olan birçok modifikasyon geliştirilmiştir22. Bu ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekler ve spiroketleri kene, memeli ve klinik örneklerden izole etmek için kullanılmıştır23. Daha yakın zamanda geliştirilen varyasyon, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı, yeni Borrelia izolatlarını çevresel örneklerden izole ederken, kültürü tohumlamak için mevcut numunede bulunan spiroket sayısı düşük olduğunda daha iyi izolasyon başarısı, morfoloji ve motilite, 23,24 sağlayabilir. Her durumda, yetiştiriciliğin başarısı kritik olarak taze hazırlanmış ortama ve uygun bileşenlerin kullanımına bağlıdır; Tüm ticari bileşenler yüksek kaliteli ortam üretmez. Aşılanmış kültürler, az miktarda artık ortam oksijeni varlığında geleneksel bir 32-34 ° C inkübatörde sallanmadan rahatça inkübe edilebilir. Borrelia spiroketleri anaeroblardır, ancak doğada oksijen ve karbondioksit konsantrasyonlarındaki dalgalanmalara maruz kalırlar ve gen ekspresyonundaki değişikliklerle yanıt verirler26,27,28,29. Bu nedenle, gen ekspresyonu, büyüme ve diğer metabolik çalışmalar, oksijen kontrollü bir inkübatör veya anaerobik oda kullanılarak oksijen ve karbondioksit seviyelerini kontrol etmelidir. Kültürde, kültürler haftalık olarak veya daha sık, karanlık alan mikroskobu veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketlerin varlığı açısından kontrol edilir. Kültür yaymaları gümüş lekeleri, immünohistokimya veya floresan etiketli suşların kullanımı ileboyanabilir 29,30. PCR'yi takiben DNA dizilimi, Borrelia türlerini30,31,32,33 tespit etmek ve genetik olarak tanımlamak veya doğrulamak için hassas ve spesifik bir yöntemdir.
BSK-II üzerinde birçok küçük varyasyon mevcuttur ve bazıları ticari olarak temin edilebilir. Burada bölüm 1'de açıklanan protokol Barbour (1984)21'den uyarlanmıştır. Sıvı MKP ortamı daha yeni geliştirilmiş bir ortamdır ve bölüm 2'de açıklanmıştır. BSK ortamına benzer şekilde iki adımdan oluşan daha önce bildirilen bir protokol33,34'e göre hazırlanır: temel ortamın hazırlanması ve tam ortamın hazırlanması. Borrelia kültür ortamı, bölüm 3'te açıklandığı gibi antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak hazırlanabilir; Antibiyotikler, bölüm 4'te açıklandığı gibi, klinik veya çevresel örneklerle aşılama sırasında ortaya çıkan kirletici bakterileri azaltmak için hareket eder; saf Borrelia sp. kültürü ile aşılanırsa, antibiyotiklere ihtiyaç duyulmayabilir. Uzun vadeli Borrelia stokları yapmak genellikle önemlidir ve bunu yapmak için bir protokol bölüm 5'te açıklanmıştır. Bölüm 6, saf Borrelia sensu lato klonlarını klinik veya çevresel örneklerden izole etmek için bu ortamların kullanılmasını açıklamaktadır. Olası bir dizi yaklaşım vardır36; Aşağıda etkili olduğu tespit edilen bir tanesi verilmiştir. Bu protokolde kullanılan kaplama ortamı, BSK-II kaplama ortamı 37 ve MKP ortamı34'ün bir modifikasyonudur (tavşan serumu% 10'a yükseltilmiş) 38).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#160;&#181;m Sterile syringe filter&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT10XLS3</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229011B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>188261</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309661</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT200</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Screw Cap Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933C</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipettes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229025B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Sterile syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7409</td>
			<td>Source is important - see note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipettes&#160;</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229006B</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229421</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 ml MKP glass tubes&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Nr. 26 135 115</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1654</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Brucella broth&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>211088</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>302419100</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes (yellow top - ACD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD&#160;Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]&#160;</td>
			<td>Darlynn biologicals</td>
			<td>BB83-500</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model 5430</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid TrisodiumSaltDihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8532 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>21540 500 mL</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-510-018</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Tubes (Nalgene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Petri with stacking ring 100 mm &#215; 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7741</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model 1545</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for filter sterilization</td>
			<td>Millipore 0.22&#956;m GPExpressPLUS Membrane</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco BD</td>
			<td>214340 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>99449-20</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021 1 kg</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemafuge (Hematocrit &#38; Immuno hematology centrifuge )</td>
			<td>Labwissen</td>
			<td>Model 3220</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H-3784 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylglucoseamine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A-3286 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neopeptone</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>211681 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hematocytometer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope&#160;</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5396</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Standard Balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>model TS200S</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8574 25 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16-120-032</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Serum&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-4505&#160; 100 mL</td>
			<td>Source is important&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761&#160;&#160;&#160;&#160; 500 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufametaxazole&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1126</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Yeastolate</td>
			<td>Difco&#160; BD</td>
			<td>255752 100 g</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-044</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1056</td>
			<td>Standard item - any supplier will do</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation methods of spirochetes from borrelia burgdorferi sensu lato complex and relapsing fever borrelia

Borrelia, B. burgdorferi sensu lato (s.l.) olarak da bilinen ve yakın zamanda Borreliella, tekrarlayan ateş (RF) grubu Borrelia ve üçüncü bir sürüngen ilişkili spiroket grubu olarak yeniden sınıflandırılan Lyme borreliosis (LB) grubundan oluşan üç tür grubundan oluşur. Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespiti için altın standart olmaya devam etmektedir, çünkü vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar. Borrelia ve Borreliella spiroketleri titiz ve yavaş büyür ve bu nedenle klinik amaçlar için yaygın olarak kültürlenmezler; Ancak, araştırma için kültür gereklidir. Bu protokol, B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ve RFspiroketleri, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ve B. miyamotoi. LB ve RF spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekleyen Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II veya BSK-H) ortamıdır. İnokulumda başlangıç spiroket sayısının düşük olduğu kene veya konakçı kaynaklı örneklerden yeni izole edilmiş Borrelia izolatlarını yetiştirebilmek için, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı tercih edilir. Bu ortam aynı zamanda B. miyamotoi'nin büyümesini de destekler.RF spiroketlerin yetiştiriciliğinin başarısı da kritik olarak bileşenlerin kalitesine bağlıdır.

Borrelia kültür ortamı BSK ve MKP ve varyantları, sırayla hazırlanması ve sterilize edilmesi gereken bileşenlere sahip zengin kültür ortamlarıdır. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve berrak olmalıdır (Şekil 1). Isınmadan sonra devam eden bulanıklık ve yağış, sorunlu içerikleri, orta üretimi veya kontaminasyonu gösterir; Böyle bir ortam en iyi şekilde atılır. BSK'ya ve MKP'ye jelatin eklenirse, ortam soğutulduğunda jelatinli ola...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia at JoVE.com

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

İn vitro kültür, canlı bakterilerin varlığı için doğrudan bir tespit yöntemidir. Bu protokol, Borrelia burgdorferi sensu lato kompleksi, tekrarlayan ateş Borrelia türleri ve Borrelia miyamotoi dahil olmak üzere çeşitli Borrelia spiroketlerinin kültürü için yöntemleri açıklamaktadır. Bu türler titiz ve yavaş büyür, ancak kültürlenebilir.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Kompleksi ve Tekrarlayan Ateş Borrelia'dan Spiroketlerin Yetiştirme Yöntemleri

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelia, üç ana türü kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir. Lyme Borreliosis grubu, Relapsing Fever grubu ve sürüngenlerde bulunan daha az iyi karakterize edilmiş grup. Birçok Borrelia türü patojeniktir.Bakteri kültürü, enfeksiyonun tespiti için altın standarttır. Bu hem araştırma hem de klinik çalışmalar için geçerlidir. Vücut sıvısından ve dokularından alınan bakteri kültürü, bakterilerin hem canlı hem de çoğaldığını doğrular.Bu protokol, Lyme Borreliosis spiroket grubunu, Relapsing Fever Borrelia ve Borrelia miyamotoi'yi başarılı bir şekilde kültürlemek ve korumak için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Daha önce izole edilmiş türlerin ve suşların yanı sıra çevresel veya memeli kaynaklarından yeni izolatlar ve monoklonal izolatların kültürü için yöntemler sağlanmıştır. Prosedürü gösteren, doktora sonrası araştırmacı Marie-Line Faucillion ve Bergstrom Laboratuvarı'ndan teknisyen Ingela Nilsson, Lloyd Laboratuvarı'ndan araştırma görevlisi Anne Berthold ve Rudenko Laboratuvarı'ndan araştırma görevlisi Maryna Golovchenko olacak.Başlamak için, bir litre Barbara-Stoner-Kelly veya BSK-II ortamı hazırlamak için gereken reaktifleri edinin. BSA'yı suyu karıştırarak bir beherde çözerek başlayın. Daha sonra tüm kuru kimyasalları ekleyin ve CMRL eklemeden önce çözünmelerini bekleyin.Ortamın pH'ını 7.6'ya ayarlayın. Gerekirse, bir molar sodyum hidroksit kullanın. Daha sonra, ortama% altı ila% 10'luk bir konsantrasyona tavşan serumu ekleyinBakteriyel büyüme güçlü değilse, ortama bir tane daha% 2 serum ekleyin.Daha sonra ortamı 0.22 mikron gözenekli bir filtre kullanarak sterilize edin. Ortamın stokunu 100 veya 400 mililitre alikotta dondurun. Relapsing Fever suşları için, 400 mililitre BSK-II ortamına 100 mililitre% 7 steril jelatin ekleyin.Yüzeyi ve tüm malzemeleri %7 etanol ile dezenfekte edin ve derhal biyolojik güvenlik kabinine aktarın. UV, biyolojik olmayan tüm malzemeleri çalışmaya başlamadan önce beş dakika boyunca sterilize eder. Bir kültürü başlatmak için, ortamı bir inkübatörde önceden ısıtın.Daha sonra bir gliserol stoğundan beş ila 15 mililitre önceden ısıtılmış BSK ortamına bir mililitre çözülmüş Borrelia kültürü ekleyin. Kapatmadan önce mikro veya anaerobik bir atmosfer oluşturmak için tüpleri neredeyse tamamen doldurun. 37 santigrat derecede Relapsing Fever türlerini ve 33 ila 34 santigrat derecede Borrelia burgdorferi sensu lato türlerini yetiştirin.Borrelia kültürünün büyümesini, faz kontrastı veya karanlık alan mikroskobu kullanarak 200 ila 400 kat büyütmede izleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültürü serolojik bir pipetle karıştırın veya yukarı ve aşağı pipetleme yaparken üç mililitrelik bir transfer pipeti kullanın. Daha sonra sayım için bir hemositometrenin her iki tarafındaki 10 mikrolitre kültür aliquot'a yükleyin.Daha sonra, üstel faz Borrelia kültürünü bire iki veya bire dört oranında 1.7 mililitrelik bir tüpte bir ortamla seyreltin. Hücre sayısını belirlerken, seyreltme faktörünü uygun şekilde göz önünde bulundurun. Kullandıktan sonra, yüzeylere ve hemositometreye% 10 seyreltilmiş ağartıcı ve/veya %70 etanol püskürtün.DNA'nın ekstraksiyonu veya Borrelia hücrelerinin izolasyonu için, üstel faz kültürünü 4.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı uygun bir biyolojik tehlike atığına atın. Peletlenmiş bakterileri ticari bir DNA ekstraksiyon kiti ile işleyin veya amaçlanan deney için uygun bir ortamda askıya alın. Her deneyin sonunda, tüm ekipmanı etanol ve UV radyasyonu ile sterilize edin.Fazla kültür de dahil olmak üzere sıvı atıkları bir atık şişesinde toplayın ve% 10 çamaşır suyu ekleyin. Şişeyi atmadan önce 80 santigrat dereceye yerleştirin. Borrelia kültürlerinin uzun süreli depolanması için, mililitre başına 10 milyon ila 100 milyon hücrede üstel faz kültürünün istenen hacmini alın,% 10 steril gliserol ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Karışımın 1.5 mililitre alikotunu iki mililitre vidalı kapaklı kriyojenik şişelere aktarın. Stok şişelerini 80 santigrat derecede saklayın. Dondurucudaki her suşun en az 10 tüpü olan bir stoğu koruyun, Borrelia'yı sert kenelerden yetiştirmek için yetişkin dişileri, erkekleri ve nimf kenelerini toplayın.Yüzey sterilize ederek keneleri iki dakika boyunca% 70 etanol içine batırın ve bir biyogüvenlik kabininde hava ile kurutun. Daha sonra, steril bir neşter kullanarak keneleri ayrı ayrı birkaç parçaya ayırın. Daha sonra parçaları, antibiyotiklerle desteklenmiş 1.5 mililitre ortam içeren iki mililitrelik tüpe yerleştirin.Kültürleri 34 santigrat derecede inkübe edin ve ilk iki hafta boyunca haftada iki kez karanlık alan veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketleri kontrol edin ve bundan sonra altı hafta boyunca haftada bir kontrol edin. Borrelia'yı kan örneklerinden yetiştirmek için, plazmayı tüpten yavaşça çıkarın ve bir mililitre plazmayı beş mililitre önceden ısıtılmış, Modifiye Kelly-Pettenkofer veya MKP Tam ortama aşılayın. Borrelia'nın cilt biyopsisinden yetiştirilmesi için, yüzey cilt biyopsisini% 70 etanol ve hidrojen peroksit ile sterilize eder.Daha sonra biyopsi örneğini fizyolojik salin içine yerleştirin. Fizyolojik saline batırılmışken cam Petri kabında steril bir tıraş bıçağı kullanarak numuneyi iki ila altı küçük parçaya bölün. Doğranmış numuneyi ve cilt biyopsisinin depolandığı bir mililitre salini, antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre önceden ısıtılmış ortama aktarın ve 33 santigrat derecede inkübe edin.Plaka yapmak için, sıcak 300 mililitre 1.5x BSK veya MKP Jelatinsiz komple ortam. Ayrıca ılık 200 mililitre% 1.7 agarose 55 santigrat dereceye yükseldi. Alt agar tabakasını oluşturmak için sıvıları ve pipeti her biri 15 mililitre olan 16 derin Petri kabına karıştırın.Ortamın geri kalanını bir su banyosunda tutun. Borrelia kültür yoğunluğunu ölçün ve sıvı bir ortamda istenen yoğunluğa seyreltin. Alt plakalar katılaştıktan sonra, kalan agar karışımının 10 mililitresini, uygun sayıda spiroket içeren 15 mililitrelik bir tüpe üst agar olarak ekleyin.Süspansiyonu alt agar plakasına etiketli Petri kabına dökün. Plakalar katılaştıktan sonra, onları kapatın ve% 2.5 karbondioksit içinde 34 ila 35 santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve net görünüyordu.Karşılaştırma için, MKP aşılanmamış ortam da burada gösterilmiştir. Rakip bakteriler tarafından aşırı çoğalma, ortamda bulanıklık ve kümelenmiş malzemeler oluşturur. Bakteriyel büyüme, faz kontrastı veya karanlık alan mikroskobu ile görsel inceleme ile izlendi.Üstel fazda, Borrelia hücreleri tipik olarak ince, bükülmüş ve bir dereceye kadar modaldır. Kültürler durağan faza girdikçe, yuvarlak cisimler giderek daha belirgin hale gelir. Borrelia hücreleri titizdir ve her tür ve suş ve hatta izolat, hem genetik olarak hem de izole edildikleri konakçıya adaptasyon yoluyla farklılık gösterir.Medya yaparken, uygun malzemeler Borrelia kültürünün canlılığında ve hatta kültürün yaşayabilirliğinde büyük bir fark yaratır. Borrelia spiroketleri kültüre meydan okur, ancak kültür mümkündür. Laboratuvardaki kültür, bu bakterilerin biyolojisi üzerine araştırmalar için sıçrama tahtasıdır.Kültür, Borrelia türlerinin genomunu, proteomunu, evrimini ve konakçı patojen etkileşimlerini anlamak için materyal sağlar. Borrelia kültürü, spiroketlerin tespit için yeterince bol olması birkaç hafta sürebilir. Bu, tanılama uygulamalarını sınırlar.Ancak kültür, Borrelia türlerinin mevcut, canlı ve çoğalan olup olmadığını gösterebilir ve tedavilere erişmeye yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transkripsiyon Tahlillerinin Temel Bileşenleri

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...