Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for Dr. Jie Le og Dr. Xiufen Song for deres nyttige forslag til henholdsvis differentiel interferenskontrastmikroskopi og konventionel clearingmetode. Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31870299) og Youth Innovation Promotion Association fra det kinesiske videnskabsakademi. Figur 2 blev oprettet med BioRender.com.

1. Fremstilling af opløsninger
<ol><li>Forbered FAA-fikseringsmiddel ved at tilsætte 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml iseddike og 45 ml 70% ethanol i et 50 ml centrifugerør. Hvirvel og opbevar den ved 4 °C. Frisklavet FAA-fikseringsmiddel lige før brug. FORSIGTIG: 37% formaldehyd er ætsende og potentielt kræftfremkaldende, hvis det udsættes eller indåndes. Fikseringsmidlet skal udføres i en røghætte, mens du bærer passende personlige værnemidler.</li>
	<li>Forbered rydningsopløsning ve...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

Sammenlignet med mekanisk sektionering er clearingteknologien mere fordelagtig til tredimensionel billeddannelse, da den bevarer integriteten af plantevæv eller organer16. Konventionelle rydningsprotokoller er ofte begrænset til små prøver på grund af lettere indtrængning af kemiske opløsninger. Tomatfrø er en problematisk prøve til vævsrensning, fordi den er ca. 70 gange større end et Arabidopsis-frø i størrelse og har flere permeabilitetsbarrierer. Arabidopsis frø...

Tomat (S. lycopersicum L.) er en af de vigtigste vegetabilske afgrøder rundt om i verden med en produktion på 186,8 millioner tons kødfulde frugter fra 5,1 millioner hektar i 20201. Det tilhører den store Solanaceae-familie med omkring 2.716 arter2, herunder mange kommercielt vigtige afgrøder som aubergine, peberfrugter, kartoffel og tobak. Den dyrkede tomat er en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstørrelse på ca. 900 Mb3. I lang tid er der gjort en stor indsats for tomat domesticering og avl ved at vælge ønskelige træk fra vilde Solanum spp. Der er over 5.000 tomattiltrædelser opført i Tomato Genetics Resource Center, og mere end 80.000 kimplasmer af tomater opbevares over hele verden4. Tomatplanten er flerårig i drivhuset og formeres af frø. Et modent tomatfrø består af tre hovedrum: et fuldvoksent embryo, endosperm af cellulær type og en hård frøbelægning 5,6 (figur 1A). Efter dobbelt befrugtning går udviklingen af endosperm af cellulær type forud for udviklingen af zygoter. Ved ~ 5-6 dage efter blomstring (DAF) observeres tocellet proembryo først, når endospermen består af seks til otte kerner7. I Solanum pimpinellifolium nærmer embryoet sin endelige størrelse efter 20 DAF, og frø er levedygtige til spiring efter 32 DAF8. Efterhånden som embryoet udvikler sig, absorberes endospermen gradvist, og kun en lille mængde endosperm forbliver i frøet. Den resterende endosperm består af mikropylar endosperm omkring radikelspidsen og lateral endosperm i resten af frøet 9,10. Den ydre frøbeklædning er udviklet fra fortykket og lignificeret ydre epidermis af integumentet, og med de døde lag af integumentrester danner de en hård skal for at beskytte embryoet og endospermen5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af et modent frø i Solanum lycopersicum og Arabidopsis thaliana. (A) Langsgående anatomi af et modent tomatfrø. (B) Langsgående anatomi af et modent Arabidopsisfrø. Et modent tomatfrø er ca. 70 gange større end et Arabidopsisfrø. Skalabjælker = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Produktion af tomatfrø af høj kvalitet afhænger af koordineringen mellem embryoet, endospermen og moderens frøkomponenter11. Dissekering af nøglegener og netværk i frøudvikling kræver en dyb og fuldsporet fænotypisk registrering af mutante frø. Konventionelle indlejrings-sektioneringsteknikker, såsom den halvtynde sektion og paraffinsektionen, anvendes bredt på tomatfrø for at observere de lokale og finere strukturer i embryoet12,13,14,15. Imidlertid er analyse af frøudviklingen fra tynde sektioner normalt besværlig og mangler z-akse rumlig opløsning. Til sammenligning er vævsrensning en hurtig og effektiv metode til at lokalisere udviklingsstadiet af embryodefekter, der mest sandsynligt vil forekomme16. Rydningsmetoden reducerer uigennemsigtigheden af internt væv ved at homogenisere brydningsindekset med et eller flere biokemiske midler16. Helvævsrensning tillader observation af en plantevævsstruktur uden at ødelægge dens integritet, og kombinationen af clearingteknologi og tredimensionel billeddannelse er blevet en ideel løsning til at få information om morfologien og udviklingstilstanden af et planteorgan17,18. I årenes løb er frørensningsteknikker blevet brugt i forskellige plantearter, herunder Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare og Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Blandt disse har helmonteret ægløsningsteknologi været en effektiv tilgang til at studere frøudvikling af Arabidopsis på grund af dens lille størrelse, 4-5 lag af frøbeklædningscellen og endospermen af nuklear type24,25. Med den løbende opdatering af forskellige rydningsblandinger, såsom fremkomsten af Hoyers opløsning26, blev de indre strukturer af bygæglet afbildet med en høj grad af klarhed, selvom dets endosperm udgør størstedelen af frøene. Embryogenese af sukkerroer kan observeres ved rydning kombineret med vakuumbehandling og blødgøring med saltsyre19. I modsætning til ovennævnte arter er der imidlertid ikke rapporteret om embryologiske observationer ved rydning af protokoller i tomatfrø. Dette forhindrer detaljeret undersøgelse af tomaternes embryonale og frøudvikling.
Klorhydrat anvendes almindeligvis som en rydningsopløsning, der gør det muligt at vise de nedsænkede væv og celler på forskellige optiske planer og bevarer i væsentlig grad cellerne eller vævskomponenterne27,28,29. Klorhydratbaseret clearingprotokol er med succes blevet brugt til helmontering af frø for at observere embryoet og endospermen af Arabidopsis21,28. Denne rydningsløsning er imidlertid ikke effektiv til at rydde tomatfrø, som er mere uigennemtrængelige end Arabidopsisfrø. De fysiske barrierer omfatter: (1) tomatintegumentet har næsten 20 cellelag ved 3 til 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen er cellulær type, ikke nuklear type32, og (3) tomatfrø er ca. 70 gange større i størrelse33,34 og (4) producerer store mængder frøbelægningsslimhinde, som blokerer penetrationen af rydningsreagenser og påvirker visualiseringen af embryoceller.
Derfor præsenterer denne rapport en optimeret klorhydratbaseret rydningsmetode til helmonteringsrensning af tomatfrø på forskellige stadier, hvilket muliggør dyb billeddannelse af embryoudviklingsprocessen (figur 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

Tomat (Solanum lycopersicum L.) er en af de største salgsafgrøder på verdensplan. Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Visualisering af finere embryonal struktur i et tomatfrø hæmmes ofte af frøbelægningslimhinde, flercellelags integument og en tykvægget endosperm, som skal løses ved besværlig indlejringssektion. Et enklere alternativ er at anvende vævsrensningsteknikker, der gør frøet næsten gennemsigtigt ved hjælp af kemiske agenser. Selvom konventionelle rydningsprocedurer giver mulighed for dyb indsigt i mindre frø med en tyndere frøbeklædning, er rydning af tomatfrø fortsat teknisk udfordrende, især i de sene udviklingsstadier.
Præsenteret her er en hurtig og arbejdsbesparende rydningsprotokol for at observere tomatfrøudvikling fra 3 til 23 dage efter blomstring, når embryonal morfologi er næsten færdig. Denne metode kombinerer klorhydratbaseret clearingopløsning, der i vid udstrækning anvendes i Arabidopsis med andre modifikationer, herunder udeladelse af formalin-aceto-alkohol (FAA) fiksering, tilsætning af natriumhypochloritbehandling af frø, fjernelse af den blødgjorte frøbeklædningslimhinde og vask og vakuumbehandling. Denne metode kan anvendes til effektiv rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier og er nyttig til fuld overvågning af udviklingsprocessen for mutante frø med god rumlig opløsning. Denne rydningsprotokol kan også anvendes til dyb billeddannelse af andre kommercielt vigtige arter i Solanaceae.

Når tomatfrø blev ryddet ved hjælp af en konventionel metode som i Arabidopsis, blokerede tætte endospermceller visualiseringen af tidlige tomatembryoner ved 3 DAF og 6 DAF (figur 3A, B). Da embryonets samlede volumen steg, kunne et kugleformet embryo næppe skelnes ved 9 DAF (figur 3C). Men da frøstørrelsen fortsatte med at stige, faldt dens permeabilitet, hvilket resulterede i et uklart hjerteembryo ved 12 DAF (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Denne protokol er nyttig til rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier for at observere den finere embryonale struktur.

En effektiv rydningsprotokol til undersøgelse af frøudvikling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Denne metode kan hjælpe forskere med hurtigt og ubesværet at finde unormale perioder med tomatembryoudvikling. Den største fordel ved denne protokol er en behandling af tomatfrø med natriumhypochlorit, som danner grundlag for observation af tomatembryoner. Begynd med den kemiske forberedelse og høst af Solanum lycopersicum frugter tre til 23 dage efter blomstring eller DAF.Sæt straks frugterne på is og opdel dem i tidlige, midterste og sene frugter, baseret på dagene efter blomstringen. Bryd den tidlige frugt, læg den på et dias og saml friske frø omhyggeligt med præcisionstang under 1x til 4x forstørrelse af stereomikroskopet. For midterste og sene frugter skal du bryde frugten og direkte samle friske frø ved hjælp af præcisionspincet.I den konventionelle metode overføres de friskopsamlede frø straks til et to milliliter centrifugerør indeholdende 1,5 ml FAA-fikseringsmiddel og placeres røret på orbitalrysteren ved 5 o / min i fire timer ved stuetemperatur. Dehydrer derefter frøene i 70% 95% og 100% ethanol i en time hver på en orbital shaker ved 5 o / min. Når du er færdig, skal du placere frøet i de tre til fem dråber rydningsopløsning, der findes på diaset, og forsigtigt dække det med en dækslip.Brug et enkelt konkavt dias til midterste og sene frø. Afhængigt af frøets udviklingsstadier inkuberes dem ved stuetemperatur til rydning. Efter inkubation observeres prøverne med en differentiel interferenskontrast eller DIC-mikroskop udstyret med et digitalt kamera ved 10x, 20x og 40x forstørrelse.Juster og optimer den transmitterede lysstyrke, DIC-skyder og kondensatorblænde i realtid for hver prøve og optagelse af billeder. Overfør de friske frø opsamlet fra de ødelagte frugter til et to milliliter centrifugerør indeholdende 1,5 ml desinfektionsmiddelopløsning. Inkuber prøverne på en orbital shaker ved 30 o / min i tre til 50 minutter ved stuetemperatur.Når den inderste frøbelægning er tydeligt synlig, kasseres desinfektionsopløsningen. For midterste og sene frø overføres frøene til et dias. Brug tang og en dissekeringsnål til at fjerne frøslimhinden under 1x til 4x forstørrelse af stereomikroskopet.Overfør frøene tilbage til det originale centrifugerør ved hjælp af tang. Vask dem fem gange i 1,5 ml deioniseret vand i 10 sekunder hver, og kassér det deioniserede vand. Derefter tilsættes det dobbelte volumen af rydningsopløsningen til frøene.Afhængigt af frøstadiet skal du give den intermitterende vakuumbehandling i nul til 50 minutter med 10 minutters intervaller efter hver vakuumbehandling på 10 minutter. Efter vakuumbehandling udskiftes rydningsopløsningen. For at lette rydningen af frø skal centrifugerøret beskyttes mod lys i 30 minutter til syv dage ved stuetemperatur.I tilfælde af sene embryoner udskiftes opløsningen dagligt med en frisk rydningsopløsning efterfulgt af at udsætte frøene for vakuumbehandling i 10 minutter. Placer de ryddede frø på diaset eller et enkelt konkavt dias. Brug DIC-mikroskopet udstyret med et digitalt kamera til at justere og optimere den transmitterede lysstyrke, DIC-skyder og kondensatorblænde i realtid for hver prøve og tage billedet.I den konventionelle metode til rydning af S.lycopersicum frø blokerede de tætte endospermceller visualiseringen af tidlige embryoner ved 3 og 6 DAF. Den nedsatte permeabilitet under frøvæksten resulterede i uklare billeder efter 9 DAF. Frøslimhinden og frøbeklædningen blev gradvist tættere, hvilket forhindrede indtrængen af clearingmidler fra 13 DAF og fremefter.Omridset af embryoet inde i 14 til 19 DAF-frø var ekstremt sløret, på trods af den forlængede behandlingstid på syv dage. Den indre struktur i 22 DAF-frø var helt usynlig. Den strippede frøfrakkeslimhinde produceret af frøbeklædningens epidermale celler var fremtrædende fra 13 DAF og fremefter.Natriumhypochloritbehandlingen muliggjorde en klar identifikation af den indre frøbelægning og løsrivelse af det meste af det klæbende slimhinde uden frøskader. I den optimerede rydningsprotokol viste frøene tilfredsstillende gennemsigtighed i alle testede udviklingsstadier. De forskellige cellelag i frølaget ved 3 DAF, skelnelige endospermceller ved 5 DAF, det pindformede embryo ved syv DAF, det kugleformede stadium ved 9 DAF og hjertestadiet ved 11 DAF blev observeret.I den optimerede protokol blev graden af krøllen af cotyledoner og skyde apikal meristem meget let fanget på forskellige stadier af embryonal udvikling. Sterilisering fjerner frøslimhinde og frøbelægningspigment, hvilket forbedrer frøindtrængning og visualisering. Vakuumbehandling kan fremskynde indtrængning af rydningsopløsning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til Evaluer kontraktionsfunktion af mesenchvmal-celler der undergik Epithelial-Mesenchymal Overgangseffekter

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Udvikling af en Ethanol-induceret Fibrotiske Lever Model i Zebrafisk at studere progenitorcelle-medieret hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-lokalisering af Cell Lineage Markers og tomat Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

En protokol til immunohistokemi og RNA in situ-distribution inden for tidligt drosophila-embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...