Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

De auteurs zijn Dr. Jie Le en Dr. Xiufen Song dankbaar voor hun nuttige suggesties over respectievelijk differentiële interferentiecontrastmicroscopie en conventionele clearingmethode. Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31870299) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academy of Sciences. Figuur 2 is gemaakt met BioRender.com.

1. Bereiding van oplossingen
<ol><li>Bereid FAA-fixatief voor door 2,5 ml 37% formaldehyde, 2,5 ml ijsazijn en 45 ml 70% ethanol toe te voegen in een centrifugebuis van 50 ml. Vortex en bewaar het bij 4 °C. Bereid FAA-fixatief vers voor gebruik. LET OP: 37% formaldehyde is corrosief en mogelijk kankerverwekkend bij blootstelling of inademing. Het fixatief moet worden uitgevoerd in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	<li>Bereid de opruimoplossing door 5 ml 100% glyce...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

In vergelijking met mechanische secties is de clearingtechnologie voordeliger voor driedimensionale beeldvorming omdat deze de integriteit van plantenweefsels of organen behoudt16. Conventionele clearingprotocollen zijn vaak beperkt tot kleine monsters vanwege de gemakkelijkere penetratie van chemische oplossingen. Tomatenzaad is een problematisch monster voor weefselzuivering omdat het ongeveer 70 keer groter is dan een Arabidopsis-zaad in grootte en meer permeabiliteitsbarrières heeft....

Tomaat (S. lycopersicum L.) is een van de belangrijkste groentegewassen ter wereld, met een output van 186,8 miljoen ton vlezig fruit van 5,1 miljoen hectare in 20201. Het behoort tot de grote Solanaceae-familie met ongeveer 2.716 soorten2, waaronder veel commercieel belangrijke gewassen zoals aubergine, paprika's, aardappelen en tabak. De gekweekte tomaat is een diploïde soort (2n = 2x = 24) met een genoomgrootte van ongeveer 900 Mb3. Lange tijd is er veel moeite gedaan voor het domesticeren en veredelen van tomaten door het selecteren van gewenste eigenschappen uit wilde Solanum spp. Er zijn meer dan 5.000 tomatentoetredingen vermeld in het Tomato Genetics Resource Center en meer dan 80.000 kiemplasma van tomaten worden wereldwijd opgeslagen4. De tomatenplant is overblijvend in de kas en vermeerdert zich door zaden. Een rijp tomatenzaad bestaat uit drie belangrijke compartimenten: een volgroeid embryo, resterend cellulair endosperm en een harde zaadlaag 5,6 (figuur 1A). Na dubbele bevruchting gaat de ontwikkeling van cellulair endosperm vooraf aan de ontwikkeling van zygoten. Bij ~5-6 dagen na de bloei (DAF) wordt tweecellige proembryo voor het eerst waargenomen wanneer het endosperm bestaat uit zes tot acht kernen7. In Solanum pimpinellifolium nadert het embryo zijn uiteindelijke grootte na 20 DAF en zijn zaden levensvatbaar voor ontkieming na 32 DAF8. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, wordt het endosperm geleidelijk geabsorbeerd en blijft er slechts een kleine hoeveelheid endosperm in het zaad achter. Het resterende endosperm bestaat uit micropylar endosperm rond de radikelpunt en lateraal endosperm in de rest van het zaad 9,10. De buitenste zaadlaag is ontwikkeld uit verdikte en gelamineerde buitenste epidermis van het integument, en met de dode lagen van integumentresten vormen ze een harde schaal om het embryo en endosperm5 te beschermen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van een rijp zaad in Solanum lycopersicum en Arabidopsis thaliana. (A) Longitudinale anatomie van een rijp tomatenzaad. (B) Longitudinale anatomie van een volwassen Arabidopsis zaad. Een volwassen tomatenzaad is ongeveer 70 keer groter dan een Arabidopsiszaadje . Schaalbalken = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De productie van hoogwaardige tomatenzaden hangt af van de coördinatie tussen het embryo, het endosperm en de maternale zaadcomponenten11. Het ontleden van belangrijke genen en netwerken in zaadontwikkeling vereist een diepe en full-track fenotypische opname van gemuteerde zaden. Conventionele inbeddingstechnieken, zoals de halfdunne sectie en paraffinesectie, worden op grote schaal toegepast op tomatenzaden om de lokale en fijnere structuren van het embryo te observeren 12,13,14,15. Het analyseren van de zaadontwikkeling vanuit dunne secties is echter meestal bewerkelijk en mist de ruimtelijke resolutie van de z-as. Ter vergelijking: weefselopruiming is een snelle en efficiënte methode om het ontwikkelingsstadium van embryodefecten te lokaliseren die het meest waarschijnlijk optreden16. De clearingmethode vermindert de ondoorzichtigheid van inwendig weefsel door de brekingsindex te homogeniseren met een of meer biochemische agentia16. Het opruimen van hele weefsels maakt observatie van een plantenweefselstructuur mogelijk zonder de integriteit ervan te vernietigen, en de combinatie van clearingtechnologie en driedimensionale beeldvorming is een ideale oplossing geworden om informatie te verkrijgen over de morfologie en ontwikkelingstoestand van een plantenorgaan17,18. In de loop der jaren zijn zaadzuiveringstechnieken gebruikt bij verschillende plantensoorten, waaronder Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare en Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Onder deze, de hele-mount ovule clearing technologie is een efficiënte benadering geweest voor het bestuderen van zaadontwikkeling van Arabidopsis, vanwege zijn kleine formaat, 4-5 lagen van de zaadlaagcel, en het nucleaire type endosperm24,25. Met de voortdurende actualisering van verschillende clearingmengsels, zoals de opkomst van Hoyer's oplossing26, werden interne structuren van de gerst-eicel met een hoge mate van helderheid in beeld gebracht, hoewel het endosperm het grootste deel van de zaden uitmaakt. Embryogenese van suikerbieten kan worden waargenomen door opklaring in combinatie met vacuümbehandeling en verzachting met zoutzuur19. Niettemin zijn, in tegenstelling tot de hierboven genoemde soorten, embryologische waarnemingen door clearingprotocollen in tomatenzaden niet gemeld. Dit voorkomt gedetailleerd onderzoek naar de embryonale en zaadontwikkeling van tomaten.
Chloraalhydraat wordt vaak gebruikt als een opruimoplossing waarmee de ondergedompelde weefsels en cellen op verschillende optische vlakken kunnen worden weergegeven en de cellen of weefselcomponenten aanzienlijk behouden 27,28,29. Het op chloraalhydraat gebaseerde clearingprotocol is met succes gebruikt voor het volledig opruimen van zaden om het embryo en endosperm van Arabidopsis21,28 te observeren. Deze clearingoplossing is echter niet efficiënt bij het opruimen van tomatenzaden, die ondoordringbaarder zijn dan Arabidopsis-zaden. De fysieke barrières omvatten: (1) het tomatenintegument heeft bijna 20 cellagen bij 3 tot 15 DAF30,31, (2) het tomatenendosperm is cellulair type, niet nucleair type32, en (3) tomatenzaden zijn ongeveer 70 keer groter in grootte33,34 en (4) produceren grote hoeveelheden zaadlaagslijm, wat de penetratie van clearingreagentia blokkeert en de visualisatie van embryocellen beïnvloedt.
Daarom presenteert dit rapport een geoptimaliseerde op chloraalhydraat gebaseerde clearingmethode voor het volledig opruimen van tomatenzaden in verschillende stadia, waardoor diepe beeldvorming van het embryo-ontwikkelingsproces mogelijk is (figuur 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

Tomaat (Solanum lycopersicum L.) is een van de belangrijkste cash crops wereldwijd. Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Visualisatie van de fijnere embryonale structuur in een tomatenzaad wordt vaak belemmerd door zaadlaagslijm, meercellige gelaagde omhulling en een dikwandig endosperm, dat moet worden opgelost door moeizame inbeddingssectie. Een eenvoudiger alternatief is om weefselzuiveringstechnieken te gebruiken die het zaad bijna transparant maken met behulp van chemische middelen. Hoewel conventionele opruimprocedures diep inzicht bieden in kleinere zaden met een dunnere zaadlaag, blijft het opruimen van tomatenzaden technisch uitdagend, vooral in de late ontwikkelingsstadia.
Hier wordt een snel en arbeidsbesparend clearingprotocol gepresenteerd om de ontwikkeling van tomatenzaad te observeren van 3 tot 23 dagen na de bloei wanneer de embryonale morfologie bijna voltooid is. Deze methode combineert op chloraalhydraat gebaseerde clearingoplossing die veel wordt gebruikt in Arabidopsis met andere modificaties, waaronder het weglaten van Formaline-Aceto-Alcohol (FAA) fixatie, de toevoeging van natriumhypochlorietbehandeling van zaden, verwijdering van het verzachte zaadlaagslijm en wassen en vacuümbehandeling. Deze methode kan worden toegepast voor het efficiënt opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia en is nuttig bij volledige monitoring van het ontwikkelingsproces van mutante zaden met een goede ruimtelijke resolutie. Dit clearingprotocol kan ook worden toegepast op diepe beeldvorming van andere commercieel belangrijke soorten in de Solanaceae.

Toen tomatenzaden werden geklaard met behulp van een conventionele methode zoals in Arabidopsis, blokkeerden dichte endospermcellen de visualisatie van vroege tomatenembryo's bij 3 DAF en 6 DAF (figuur 3A, B). Naarmate het totale volume van het embryo toenam, was een bolvormig embryo nauwelijks te onderscheiden bij 9 DAF (figuur 3C). Naarmate de zaadgrootte echter bleef toenemen, nam de permeabiliteit af, wat resulteerde in een wazig ha...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Dit protocol is nuttig voor het opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia om de fijnere embryonale structuur te observeren.

Een efficiënt clearingprotocol voor de studie van zaadontwikkeling in tomaat (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Deze methode kan onderzoekers helpen om snel en moeiteloos abnormale perioden van tomatenembryo-ontwikkeling te vinden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is een behandeling van tomatenzaden met natriumhypochloriet die een basis biedt voor de observatie van tomatenembryo's. Begin met de chemische bereiding en oogst van de Solanum lycopersicum vruchten drie tot 23 dagen na de bloei of DAF.Zet de vruchten onmiddellijk op ijs en verdeel ze in vroege, middelste en late vruchten, gebaseerd op de dagen na de bloei. Breek het vroege fruit, leg het op een dia en verzamel verse zaden voorzichtig met een precisietang onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop. Voor midden- en late vruchten, breek het fruit en verzamel direct verse zaden met behulp van een precisietang.Breng bij de conventionele methode de vers verzamelde zaden onmiddellijk over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter FAA-fixatief en plaats de buis op de orbitale shaker bij 5 tpm gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Droog vervolgens de zaden uit in 70% 95% en 100% ethanol gedurende elk een uur op een orbitale shaker bij 5 tpm. Als u klaar bent, plaatst u het zaad in de drie tot vijf druppels opruimoplossing die op de dia aanwezig zijn en dek het voorzichtig af met een afdekslip.Gebruik een enkele concave dia voor middelste en late zaden. Afhankelijk van de ontwikkelingsstadia van de zaden, incubeer ze bij kamertemperatuur om te worden opgeruimd. Observeer na incubatie de monsters met een differentieel interferentiecontrast of een DIC-microscoop uitgerust met een digitale camera met een vergroting van 10x, 20x en 40x.Pas de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime aan en optimaliseer deze voor elk monster en leg beelden vast. Breng de verse zaden verzameld van de gebroken vruchten over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter desinfecterende oplossing. Incubeer de monsters op een orbitale shaker bij 30 rpm gedurende drie tot 50 minuten bij kamertemperatuur.Zodra de omtrek van de binnenste zaadlaag duidelijk zichtbaar is, gooit u de desinfecterende oplossing weg. Voor middelste en late zaden, breng de zaden over op een glijbaan. Gebruik een tang en een ontleednaald om het zaadslijm te verwijderen onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop.Breng de zaden terug in de oorspronkelijke centrifugebuis met behulp van een tang. Was ze vijf keer in 1,5 milliliter gedeïoniseerd water gedurende 10 seconden elk en gooi het gedeïoniseerde water weg. Voeg vervolgens het dubbele volume van de opruimoplossing toe aan de zaden.Afhankelijk van het zaadstadium, geef de intermitterende vacuümbehandeling gedurende nul tot 50 minuten, met intervallen van 10 minuten na elke vacuümbehandeling van 10 minuten. Vervang na de vacuümbehandeling de opruimoplossing. Om het opruimen van zaden te vergemakkelijken, plaatst u de centrifugebuis beschermd tegen licht gedurende 30 minuten tot zeven dagen bij kamertemperatuur.In het geval van late embryo's, vervang de oplossing dagelijks door een verse opruimoplossing, gevolgd door de zaden gedurende 10 minuten aan een vacuümbehandeling te onderwerpen. Plaats de geruimde zaden op de glijbaan of enkele holle glijbaan. Gebruik de DIC-microscoop die is uitgerust met een digitale camera om de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime voor elk monster aan te passen en te optimaliseren en het beeld vast te leggen.In de conventionele methode om S.lycopersicumzaden te verwijderen, blokkeerden de dichte endospermcellen de visualisatie van vroege embryo's bij 3 en 6 DAF. De verminderde permeabiliteit tijdens de zaadgroei resulteerde in wazige beelden na 9 DAF. Het zaadslijm en de zaadlaag werden geleidelijk dichter, waardoor de penetratie van clearingmiddelen vanaf 13 DAF werd voorkomen.De omtrek van het embryo in 14 tot 19 DAF-zaden was extreem wazig, ondanks de verlengde behandelingstijd van zeven dagen. De interne structuur in 22 DAF-zaden was volledig onzichtbaar. Het gestripte zaadlaagslijm geproduceerd door de zaadlaag epidermale cellen was prominent vanaf 13 DAF.De natriumhypochlorietbehandeling maakte een duidelijke identificatie van de binnenste zaadlaag en loslating van het grootste deel van het aanhangende slijm mogelijk zonder zaadbeschadiging. In het geoptimaliseerde clearingprotocol vertoonden de zaden voldoende transparantie in alle geteste ontwikkelingsstadia. De verschillende cellagen van de zaadlaag bij 3 DAF, te onderscheiden endospermcellen bij 5 DAF, het stokvormige embryo bij zeven DAF, het bolvormige stadium bij 9 DAF en het hartstadium bij 11 DAF werden waargenomen.In het geoptimaliseerde protocol werd de mate van de krul van zaadlobben en scheut apicale meristeem zeer gemakkelijk vastgelegd in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling. Sterilisatie verwijdert zaadslijm en zaadlaagpigment, wat de zaadpenetratie en visualisatie verbetert. Vacuümbehandeling kan de penetratie van de clearingoplossing versnellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-localisatie van Cell Lineage Markers en de tomaat Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen