Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Les auteurs remercient le Dr Jie Le et le Dr Xiufen Song pour leurs suggestions utiles sur la microscopie différentielle à contraste interférentiel et la méthode de compensation conventionnelle, respectivement. Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31870299) et l’Association de promotion de l’innovation des jeunes de l’Académie chinoise des sciences. La figure 2 a été créée avec BioRender.com.

1. Préparation des solutions
<ol><li>Préparer le fixateur FAA en ajoutant 2,5 mL de formaldéhyde à 37 %, 2,5 mL d’acide acétique glacial et 45 mL d’éthanol à 70 % dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et conserver à 4 °C. Préparer fraîchement le fixateur FAA juste avant utilisation. ATTENTION : 37 % de formaldéhyde est corrosif et potentiellement cancérogène en cas d’exposition ou d’inhalation. Le fixateur doit être effectué dans une hotte tout en portant un équipeme...

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	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. 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Par rapport à la section mécanique, la technologie de nettoyage est plus avantageuse pour l’imagerie tridimensionnelle car elle conserve l’intégrité des tissus ou organes végétaux16. Les protocoles de nettoyage conventionnels sont souvent limités à de petits échantillons en raison de la pénétration plus facile des solutions chimiques. La graine de tomate est un échantillon problématique pour le nettoyage des tissus car elle est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’A...

La tomate (S. lycopersicum L.) est l’une des cultures légumières les plus importantes au monde, avec une production de 186,8 millions de tonnes de fruits charnus sur 5,1 millions d’hectares en 20201. Il appartient à la grande famille des solanacées avec environ 2 716 espèces2, y compris de nombreuses cultures commercialement importantes telles que l’aubergine, les poivrons, la pomme de terre et le tabac. La tomate cultivée est une espèce diploïde (2n = 2x = 24) avec une taille de génome d’environ 900 Mb3. Pendant longtemps, de grands efforts ont été faits pour la domestication et la reproduction de la tomate en sélectionnant des caractères souhaitables chez Solanum spp. Il y a plus de 5 000 accessions de tomates répertoriées dans le Centre de ressources génétiques sur la tomate et plus de 80 000 germoplasmes de tomates sont stockés dans le monde4. Le plant de tomate est vivace en serre et se propage par graines. Une graine de tomate mature se compose de trois compartiments principaux : un embryon adulte, un endosperme résiduel de type cellulaire et un tégument dur 5,6 (figure 1A). Après une double fécondation, le développement de l’endosperme de type cellulaire précède le développement des zygotes. À ~5-6 jours après la floraison (DAF), le proembryon bicellulaire est observé pour la première fois lorsque l’endosperme est constitué de six à huit noyaux7. Chez Solanum pimpinellifolium, l’embryon approche de sa taille finale après 20 DAF, et les graines sont viables pour la germination après 32 DAF8. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, l’endosperme est progressivement absorbé et seule une petite quantité d’endosperme reste dans la graine. L’endosperme résiduel est constitué d’endosperme micropylaire entourant l’extrémité radiculaire et d’endosperme latéral dans le reste de la graine 9,10. Le tégument externe est développé à partir de l’épiderme externe épaissi et lignifié du tégument, et avec les couches mortes de restes de tégument, ils forment une coquille dure pour protéger l’embryon et l’endosperme5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique d’une graine mature chez Solanum lycopersicum et Arabidopsis thaliana. (A) Anatomie longitudinale d’une graine de tomate mature. (B) Anatomie longitudinale d’une graine d’Arabidopsis mature. Une graine de tomate mûre est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’Arabidopsis. Barres d’échelle = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La production de semences de tomates de haute qualité dépend de la coordination entre l’embryon, l’endosperme et les composants maternelsdes semences 11. La dissection de gènes et de réseaux clés dans le développement des semences nécessite un enregistrement phénotypique approfondi et complet des graines mutantes. Les techniques conventionnelles d’encastrement-section, telles que la section semi-mince et la section de paraffine, sont largement appliquées aux graines de tomates pour observer les structures locales et plus fines de l’embryon12,13,14,15. Cependant, l’analyse du développement des graines à partir de sections minces est généralement laborieuse et manque de résolution spatiale de l’axe z. En comparaison, la clairsemage tissulaire est une méthode rapide et efficace pour déterminer le stade de développement des anomalies embryonnaires les plus susceptibles de se produire16. La méthode de nettoyage réduit l’opacité des tissus internes en homogénéisant l’indice de réfraction avec un ou plusieurs agents biochimiques16. Le nettoyage des tissus entiers permet d’observer la structure d’un tissu végétal sans détruire son intégrité, et la combinaison de la technologie de nettoyage et de l’imagerie tridimensionnelle est devenue une solution idéale pour obtenir des informations sur la morphologie et l’état de développement d’un organe végétal17,18. Au fil des ans, des techniques de débroussaillage ont été utilisées chez diverses espèces végétales, notamment Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare et Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Parmi celles-ci, la technologie de défrichage des ovules à montage entier a été une approche efficace pour étudier le développement des graines d’Arabidopsis, en raison de sa petite taille, de ses 4-5 couches de cellules de tégument et de l’endosperme de type nucléaire24,25. Avec la mise à jour continue de différents mélanges de nettoyage, tels que l’émergence de la solution26 de Hoyer, les structures internes de l’ovule d’orge ont été imagées avec un haut degré de clarté, bien que son endosperme constitue la majeure partie des graines. L’embryogenèse de la betterave sucrière peut être observée par débroussaillage combiné à un traitement sous vide et ramollissement à l’acide chlorhydrique19. Néanmoins, contrairement aux espèces mentionnées ci-dessus, les observations embryologiques par protocoles de nettoyage dans les graines de tomates n’ont pas été rapportées. Cela empêche une étude détaillée du développement embryonnaire et des semences de tomates.
L’hydrate de chloral est couramment utilisé comme solution de compensation qui permet aux tissus immergés et aux cellules d’être affichés sur différents plans optiques et préserve considérablement les cellules ou les composants tissulaires27,28,29. Le protocole de nettoyage à base d’hydrate de chloral a été utilisé avec succès pour le nettoyage complet des graines afin d’observer l’embryon et l’endosperme d’Arabidopsis21,28. Cependant, cette solution de nettoyage n’est pas efficace pour éliminer les graines de tomates, qui sont plus imperméables que les graines d’Arabidopsis. Les barrières physiques comprennent: (1) le tégument de la tomate a près de 20 couches cellulaires à 3 à 15 DAF 30,31, (2) l’endosperme de la tomate est de type cellulaire, pas de type nucléaire32, et (3) les graines de tomate sont environ 70 fois plus grandes en taille33,34 et (4) produisent de grandes quantités de mucilage de tégument, ce qui bloque la pénétration des réactifs d’élimination et affecte la visualisation des cellules embryonnaires.
Par conséquent, ce rapport présente une méthode optimisée de nettoyage à base d’hydrate de chloral pour l’élimination complète des graines de tomates à différents stades, ce qui permet une imagerie approfondie du processus de développement de l’embryon (Figure 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

La tomate (Solanum lycopersicum L.) est l’une des principales cultures commerciales au monde. La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. La visualisation d’une structure embryonnaire plus fine dans une graine de tomate est souvent entravée par le mucilage du tégument, le tégument multicellulaire et un endosperme à paroi épaisse, qui doit être résolu par une encastre-section laborieuse. Une alternative plus simple consiste à utiliser des techniques de nettoyage des tissus qui rendent la graine presque transparente à l’aide d’agents chimiques. Bien que les procédures de défrichage conventionnelles permettent de mieux comprendre les petites graines avec un tégument plus mince, le défrichement des semences de tomates continue d’être techniquement difficile, en particulier dans les derniers stades de développement.
Un protocole de défrichement rapide et économique permet d’observer le développement des graines de tomates de 3 à 23 jours après la floraison, lorsque la morphologie embryonnaire est presque terminée. Cette méthode combine une solution de nettoyage à base d’hydrate de chloral largement utilisée chez Arabidopsis avec d’autres modifications, y compris l’omission de la fixation formol-acéto-alcool (FAA), l’ajout d’un traitement à l’hypochlorite de sodium des graines, l’élimination du mucilage ramolli du tégument et le lavage et le traitement sous vide. Cette méthode peut être appliquée pour un nettoyage efficace des graines de tomates à différents stades de développement et est utile pour le suivi complet du processus de développement des graines mutantes avec une bonne résolution spatiale. Ce protocole de défrichage peut également être appliqué à l’imagerie en profondeur d’autres espèces commercialement importantes dans les Solanaceae.

Lorsque les graines de tomates ont été éliminées à l’aide d’une méthode conventionnelle comme chez Arabidopsis, des cellules endospermatiques denses ont bloqué la visualisation des embryons de tomates précoces à 3 DAF et 6 DAF (Figure 3A,B). Au fur et à mesure que le volume total de l’embryon augmentait, un embryon globulaire était à peine discernable à 9 DAF (Figure 3C). Cependant, à mesure que la taille de la grain...

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An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. Ce protocole est utile pour éliminer les graines de tomates à différents stades de développement afin d’observer la structure embryonnaire plus fine.

Un protocole de défrichement efficace pour l’étude du développement des semences de tomates (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Cette méthode peut aider les recherches à trouver rapidement et sans effort des périodes anormales de développement de l’embryon de tomate. Le principal avantage de ce protocole est un traitement des graines de tomate avec de l’hypochlorite de sodium qui fournit une base pour l’observation des embryons de tomates. Commencez par la préparation chimique et la récolte des fruits de Solanum lycopersicum trois à 23 jours après la floraison ou le DAF.Mettez immédiatement les fruits sur la glace et divisez-les en fruits précoces, moyens et tardifs, en fonction des jours suivant la floraison. Casser le fruit précoce, le mettre sur une lame et recueillir soigneusement les graines fraîches avec une pince de précision sous un grossissement de 1x à 4x du stéréomicroscope. Pour les fruits moyens et tardifs, cassez les fruits et collectez directement les graines fraîches à l’aide d’une pince de précision.Dans la méthode conventionnelle, transférer immédiatement les graines fraîchement récoltées dans un tube centrifuge de deux millilitres contenant 1,5 millilitre de fixateur FAA et placer le tube sur l’agitateur orbital à 5 tr / min pendant quatre heures à température ambiante. Déshydratez ensuite les graines à 70%95% et 100% d’éthanol pendant une heure chacune sur un agitateur orbital à 5 rpm. Une fois cela fait, placez la graine dans les trois à cinq gouttes de solution de nettoyage présentes sur la lame et recouvrez-la délicatement d’un couvercle.Utilisez une seule lame concave pour les graines moyennes et tardives. Selon les stades de développement des graines, incuber à température ambiante pour le nettoyage. Après incubation, observez les échantillons avec un contraste d’interférence différentiel, ou un microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique à grossissement 10x, 20x et 40x.Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images. Transférer les graines fraîches recueillies sur les fruits cassés dans un tube à centrifuger de deux millilitres contenant 1,5 millilitre de solution désinfectante. Incuber les échantillons sur un agitateur orbital à 30 rpm pendant trois à 50 minutes à température ambiante.Une fois que le contour le tégument le plus interne est clairement visible, jetez la solution désinfectante. Pour les graines moyennes et tardives, transférez les graines sur une lame. Utilisez une pince et une aiguille à dissection pour enlever le mucilage de la graine sous un grossissement de 1x à 4x du stéréomicroscope.Transférez les graines dans le tube centrifuge d’origine à l’aide d’une pince. Lavez-les cinq fois dans 1,5 millilitre d’eau désionisée pendant 10 secondes chacun et jetez l’eau désionisée. Ensuite, ajoutez le double volume de la solution de défrichage aux graines.Selon le stade de semence, administrer le traitement intermittent sous vide pendant zéro à 50 minutes, à intervalles de 10 minutes après chaque traitement sous vide de 10 minutes. Après le traitement sous vide, remplacez la solution de dégagement. Pour faciliter l’élimination des graines, placez le tube centrifuge à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à sept jours à température ambiante.Dans le cas d’embryons tardifs, remplacer la solution quotidiennement par une solution de clairage fraîche, puis soumettre les graines à un traitement sous vide pendant 10 minutes. Placez les graines dégagées sur la lame ou sur la lame concave unique. À l’aide du microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique, ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez l’image.Dans la méthode conventionnelle d’élimination des graines de S. lycopersicum, les cellules endospermes denses bloquaient la visualisation des embryons précoces à 3 et 6 DAF. La diminution de la perméabilité pendant la croissance des graines a entraîné des images floues après 9 DAF. Le mucilage et le tégument des graines se sont progressivement densifiés, empêchant la pénétration des agents de défrichement à partir de 13 DAF.Le contour de l’embryon à l’intérieur de 14 à 19 graines DAF était extrêmement flou, malgré la durée prolongée du traitement de sept jours. La structure interne de 22 graines DAF était complètement invisible. Le mucilage du tégument dénudé produit par les cellules épidermiques du tégument était proéminent à partir de 13 DAF.Le traitement à l’hypochlorite de sodium a permis d’identifier clairement le tégument interne et de se détacher de la majeure partie du mucilage adhérent sans endommager les graines. Dans le protocole de nettoyage optimisé, les graines ont montré une transparence satisfaisante à tous les stades de développement testés. Les couches cellulaires distinctes du tégument à 3 DAF, les cellules endospermes distinguables à 5 DAF, l’embryon en forme de bâtonnet à sept DAF, le stade globulaire à 9 DAF et le stade cardiaque à 11 DAF ont été observées.Dans le protocole optimisé, le degré de la boucle des cotylédons et du méristème apical des pousses a été très facilement capturé à différents stades du développement embryonnaire. La stérilisation élimine le mucilage des graines et le pigment du tégument, ce qui améliore la pénétration et la visualisation des graines. Le traitement sous vide peut accélérer la pénétration de la solution de nettoyage.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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