Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

लेखक क्रमशः अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी और पारंपरिक समाशोधन विधि पर उनके उपयोगी सुझावों के लिए डॉ जी ले और डॉ जियूफेन सोंग के आभारी हैं। इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31870299) और चीनी विज्ञान अकादमी के युवा नवाचार संवर्धन संघ द्वारा वित्तपोषित किया गया था। चित्र 2 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

1. समाधान तैयार करना
<ol><li>50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 37% फॉर्मलाडेहाइड के 2.5 एमएल, ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 2.5 एमएल और 70% इथेनॉल के 45 एमएल को जोड़कर एफएए फिक्सेटिव तैयार करें। भंवर और इसे 4 डिग्री सेल्स?...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. 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E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

यांत्रिक सेक्शनिंग की तुलना में, समाशोधन तकनीक त्रि-आयामी इमेजिंग के लिए अधिक फायदेमंद है क्योंकि यह पौधे के ऊतकों या अंगों की अखंडता को बरकरार रखतीहै। रासायनिक समाधानों के आसान प्रवेश के का...

टमाटर (एस लाइकोपर्सिकम एल) दुनिया भर में सबसे महत्वपूर्ण सब्जी फसलों में से एक है, जिसमें 2020 में 5.1 मिलियन हेक्टेयर से 186.8 मिलियन टन मांसल फलों का उत्पादन होता है। यह लगभग 2,716 प्रजातियों2 के साथ बड़े सोलानासी परिवार से संबंधित है, जिसमें बैंगन, मिर्च, आलू और तंबाकू जैसी कई व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण फसलें शामिल हैं। खेती की गई टमाटर एक द्विगुणित प्रजाति (2n = 2x = 24) है जिसका जीनोम आकार लगभग 900 Mb3 है। लंबे समय से, जंगली सोलनम एसपीपी से वांछनीय लक्षणों का चयन करके टमाटर को पालतू बनाने और प्रजनन की दिशा में बहुत प्रयास किया गया है। टमाटर जेनेटिक्स रिसोर्स सेंटर में 5,000 से अधिक टमाटर परिग्रहण सूचीबद्ध हैंऔर टमाटर के 80,000 से अधिक जर्मप्लाज्म दुनिया भर में संग्रहीत हैं। टमाटर का पौधा ग्रीनहाउस में बारहमासी होता है और बीजों द्वारा फैलता है। एक परिपक्व टमाटर के बीज में तीन प्रमुख डिब्बे होते हैं: एक पूर्ण विकसित भ्रूण, अवशिष्ट सेलुलर-प्रकार एंडोस्पर्म, और एक कठोर बीज कोट 5,6 (चित्रा 1 ए)। दोहरे निषेचन के बाद, सेलुलर-प्रकार के एंडोस्पर्म का विकास युग्मनज के विकास से पहले होता है। फूल (डीएएफ) के ~ 5-6 दिनों के बाद, दो-कोशिका वाले प्रोम्ब्रायो को पहली बार देखा जाता है जब एंडोस्पर्म में छह से आठ नाभिकहोते हैं। सोलनम पिंपिनेलिफोलियम में, भ्रूण 20 डीएएफ के बाद अपने अंतिम आकार तक पहुंचता है, और बीज 32 डीएएफ 8 के बाद अंकुरण के लिए व्यवहार्यहोते हैं। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, एंडोस्पर्म धीरे-धीरे अवशोषित हो जाता है और बीज में एंडोस्पर्म की केवल थोड़ी मात्रा रह जाती है। अवशिष्ट एंडोस्पर्म में रेडियल टिप के आसपास माइक्रोपाइलर एंडोस्पर्म और शेष बीज 9,10 में पार्श्व एंडोस्पर्म होते हैं। बाहरी बीज कोट को इन्टेगुमेंट के मोटे और लिग्निफाइड बाहरी एपिडर्मिस से विकसित किया जाता है, और इन्टेगुमेंट अवशेषों की मृत परतों के साथ, वे भ्रूण और एंडोस्पर्म5 की रक्षा के लिए एक कठोर खोल बनाते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> चित्र 1: सोलनम लाइकोपर्सिकम और एराबिडोप्सिस थैलियाना में एक परिपक्व बीज का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) एक परिपक्व टमाटर के बीज की अनुदैर्ध्य शारीरिक रचना। (बी) एक परिपक्व एराबिडोप्सिस बीज की अनुदैर्ध्य शारीरिक रचना। एक परिपक्व टमाटर का बीज एराबिडोप्सिस बीज की तुलना में आकार में लगभग 70 गुना बड़ा होता है। स्केल पट्टियाँ = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
उच्च गुणवत्ता वाले टमाटर के बीज का उत्पादन भ्रूण, एंडोस्पर्म और मातृ बीज घटकों के बीच समन्वय पर निर्भर करताहै। बीज विकास में प्रमुख जीन और नेटवर्क को विच्छेदित करने के लिए उत्परिवर्ती बीजों की गहरी और पूर्ण-ट्रैक फेनोटाइपिक रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। पारंपरिक एम्बेडिंग-सेक्शनिंग तकनीक, जैसे अर्ध-पतले खंड और पैराफिन अनुभाग, भ्रूण 12,13,14,15 की स्थानीय और महीन संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए टमाटर के बीज पर व्यापक रूप से लागू होते हैं। हालांकि, पतले वर्गों से बीज विकास का विश्लेषण करना आमतौर पर श्रमसाध्य होता है और जेड-अक्ष स्थानिक संकल्प का अभाव होता है। इसकी तुलना में, ऊतक समाशोधन भ्रूण दोषों के विकास चरण को इंगित करने के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका हैजो होने की सबसे अधिक संभावना है। समाशोधन विधि एक या अधिक जैव रासायनिक एजेंटों के साथ अपवर्तक सूचकांक को समरूप करके आंतरिक ऊतक की अपारदर्शिता को कम करतीहै। संपूर्ण ऊतक समाशोधन इसकी अखंडता को नष्ट किए बिना एक पौधे के ऊतक संरचना के अवलोकन की अनुमति देता है, और समाशोधन तकनीक और त्रि-आयामी इमेजिंग का संयोजन एक पौधे के अंग17,18 की आकृति विज्ञान और विकासात्मक स्थिति पर जानकारी प्राप्त करने के लिए एक आदर्श समाधान बन गया है। वर्षों से, विभिन्न पौधों की प्रजातियों में बीज समाशोधन तकनीकों का उपयोग किया गया है, जिसमें एराबिडोप्सिस थैलियाना, होर्डियम वल्गर और बीटा वल्गरिस19,20,21,22,23 शामिल हैं। इनमें से, होल-माउंट डिंब समाशोधन तकनीक एराबिडोप्सिस के बीज विकास का अध्ययन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण रही है, इसके छोटे आकार, बीज कोट सेल की 4-5 परतों और परमाणु-प्रकार एंडोस्पर्म24,25 के कारण। विभिन्न समाशोधन मिश्रणों के निरंतर अद्यतन के साथ, जैसे कि होयर के समाधान26 के उद्भव के साथ, जौ के अंडाणु की आंतरिक संरचनाओं को उच्च स्तर की स्पष्टता के साथ चित्रित किया गया था, हालांकि इसके एंडोस्पर्म बीज का बड़ा हिस्सा बनाते हैं। चीनी बीट के भ्रूणजनन को वैक्यूम उपचार के साथ संयुक्त रूप से साफ़ करके और हाइड्रोक्लोरिक एसिड19 के साथ नरम करके देखा जा सकता है। बहरहाल, ऊपर उल्लिखित प्रजातियों के विपरीत, टमाटर के बीज में प्रोटोकॉल को साफ़ करके भ्रूण संबंधी अवलोकनों की सूचना नहीं दी गई है। यह टमाटर के भ्रूण और बीज विकास में विस्तृत जांच को रोकता है।
क्लोरल हाइड्रेट का उपयोग आमतौर पर एक समाशोधन समाधान के रूप में किया जाता है जो डूबे हुए ऊतकों और कोशिकाओं को विभिन्न ऑप्टिकल विमानों पर प्रदर्शित करने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं या ऊतक घटकों 27,28,29 को काफी हद तक संरक्षित करता है। एराबिडोप्सिस21,28 के भ्रूण और एंडोस्पर्म का निरीक्षण करने के लिए बीजों के पूरे माउंट क्लियरिंग के लिए क्लोरल हाइड्रेट-आधारित क्लियरिंग प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, यह समाशोधन समाधान टमाटर के बीज को साफ करने में कुशल नहीं है, जो एराबिडोप्सिस बीजों की तुलना में अधिक अभेद्य हैं। भौतिक बाधाओं में शामिल हैं: (1) टमाटर के आंत में 3 से 15 डीएएफ 30,31 पर लगभग20 सेल परतें होती हैं, (2) टमाटर एंडोस्पर्म सेलुलर-प्रकार होता है, परमाणु-प्रकार32 नहीं, और (3) टमाटर के बीज आकार में लगभग 70 गुना बड़ेहोते हैं 33,34 और (4) बड़ी मात्रा में बीज कोट म्यूसिलेज का उत्पादन करते हैं, जो समाशोधन अभिकर्मकों के प्रवेश को अवरुद्ध करता है और भ्रूण कोशिकाओं के दृश्य को प्रभावित करता है।
इसलिए, यह रिपोर्ट विभिन्न चरणों में टमाटर के बीज के पूरे माउंट क्लियरिंग के लिए एक अनुकूलित क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन विधि प्रस्तुत करती है, जो भ्रूण विकास प्रक्रिया की गहरी इमेजिंग की अनुमति देती है (चित्रा 2)।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम एल) दुनिया भर में प्रमुख नकदी फसलों में से एक है। टमाटर का बीज पौधे के प्रजनन के दौरान आनुवंशिकी और विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। टमाटर के बीज के भीतर महीन भ्रूण संरचना का विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर बीज कोट म्यूसिलेज, मल्टी-सेल-लेयर्ड इंटेगुमेंट और एक मोटी दीवार वाले एंडोस्पर्म द्वारा बाधित होता है, जिसे श्रमसाध्य एम्बेडिंग-सेक्शनिंग द्वारा हल करने की आवश्यकता होती है। एक सरल विकल्प ऊतक समाशोधन तकनीकों को नियोजित करना है जो रासायनिक एजेंटों का उपयोग करके बीज को लगभग पारदर्शी बनाते हैं। यद्यपि पारंपरिक समाशोधन प्रक्रियाएं पतले बीज कोट के साथ छोटे बीजों में गहरी अंतर्दृष्टि की अनुमति देती हैं, टमाटर के बीज को साफ करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, खासकर देर से विकास के चरणों में।
यहां प्रस्तुत एक तेजी से और श्रम-बचत समाशोधन प्रोटोकॉल है जो फूल आने के 3 से 23 दिनों बाद टमाटर के बीज के विकास का निरीक्षण करता है जब भ्रूण आकृति विज्ञान लगभग पूरा हो जाता है। यह विधि एराबिडोप्सिस में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन समाधान को अन्य संशोधनों के साथ जोड़ती है, जिसमें फॉर्मलिन-एसिटो-अल्कोहल (एफएए) निर्धारण, बीजों के सोडियम हाइपोक्लोराइट उपचार को जोड़ना, नरम बीज कोट म्यूसिलेज को हटाना और धोने और वैक्यूम उपचार शामिल हैं। इस विधि को विभिन्न विकास चरणों में टमाटर के बीजों के कुशल समाशोधन के लिए लागू किया जा सकता है और अच्छे स्थानिक संकल्प के साथ उत्परिवर्ती बीजों की विकास प्रक्रिया की पूर्ण निगरानी में उपयोगी है। इस समाशोधन प्रोटोकॉल को सोलानासी में अन्य व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों की गहरी इमेजिंग पर भी लागू किया जा सकता है।

जब एराबिडोप्सिस में एक पारंपरिक विधि का उपयोग करके टमाटर के बीज को साफ किया गया था, तो घने एंडोस्पर्म कोशिकाओं ने 3 डीएएफ और 6 डीएएफ (चित्रा 3 ए, बी) पर शुरुआती टमाटर भ्रूण के विज़ुअलाइ?...

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An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

टमाटर का बीज पौधे के प्रजनन के दौरान आनुवंशिकी और विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। यह प्रोटोकॉल बेहतर भ्रूण संरचना का निरीक्षण करने के लिए विभिन्न विकास चरणों में टमाटर के बीज को साफ करने के लिए उपयोगी है।

टमाटर में बीज विकास के अध्ययन के लिए एक कुशल समाशोधन प्रोटोकॉल (सोलनम लाइकोपर्सिकम एल।

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

यह विधि टमाटर भ्रूण के विकास की असामान्य अवधि को जल्दी और आसानी से खोजने में मदद कर सकती है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ टमाटर के बीज का उपचार है जो टमाटर भ्रूण के अवलोकन के लिए एक आधार प्रदान करता है। फूल या डीएएफ के तीन से 23 दिन बाद सोलनम लाइकोपर्सिकम फलों की रासायनिक तैयारी और कटाई से शुरू करें।फलों को तुरंत बर्फ पर रखें और उन्हें फूल आने के बाद के दिनों के आधार पर शुरुआती, मध्य और देर से फलों में विभाजित करें। शुरुआती फल को तोड़ें, इसे एक स्लाइड पर रखें और स्टीरियो माइक्रोस्कोप के 1x से 4x आवर्धन के तहत सटीक बल के साथ ताजे बीजों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें। मध्य और देर से फलों के लिए, फल को तोड़ें और सटीक बल का उपयोग करके सीधे ताजा बीज इकट्ठा करें।पारंपरिक विधि में, ताजा एकत्र किए गए बीजों को तुरंत दो मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1.5 मिलीलीटर एफएए फिक्सेटिव हो और ट्यूब को कमरे के तापमान पर चार घंटे के लिए 5 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर रखें। फिर 5 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर एक घंटे के लिए बीज को 70% 95% और 100% इथेनॉल में निर्जलित करें। एक बार ऐसा करने के बाद, बीज को स्लाइड पर मौजूद समाशोधन समाधान की तीन से पांच बूंदों में रखें, और धीरे से इसे कवर स्लिप के साथ कवर करें।मध्य और देर से बीज के लिए एकल अवतल स्लाइड का उपयोग करें। बीजों के विकास चरणों के आधार पर, उन्हें साफ़ करने के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एक अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट, या डीआईसी माइक्रोस्कोप के साथ नमूने का निरीक्षण करें जो 10x, 20x और 40x आवर्धन पर डिजिटल कैमरे से लैस है।प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय में संचारित प्रकाश चमक, डीआईसी स्लाइडर और कंडेनसर एपर्चर को समायोजित और अनुकूलित करें और छवियों को कैप्चर करें। टूटे हुए फलों से एकत्र किए गए ताजे बीजों को दो मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1.5 मिलीलीटर कीटाणुनाशक समाधान हो। कमरे के तापमान पर तीन से 50 मिनट के लिए 30 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर नमूने को इनक्यूबेट करें।एक बार जब सबसे भीतरी बीज कोट की रूपरेखा स्पष्ट रूप से दिखाई देती है, तो कीटाणुनाशक समाधान को छोड़ दें। मध्य और देर से बीज के लिए, बीज को स्लाइड पर स्थानांतरित करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के 1x से 4x आवर्धन के तहत बीज म्यूसिलेज को हटाने के लिए बल और एक विच्छेदन सुई का उपयोग करें।बल का उपयोग करके बीज को मूल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें। उन्हें 1.5 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 10 सेकंड के लिए पांच बार धोएं, और विआयनीकृत पानी को छोड़ दें। इसके बाद, बीज में समाशोधन समाधान की दोहरी मात्रा जोड़ें।बीज चरण के आधार पर, 10 मिनट के प्रत्येक वैक्यूम उपचार के बाद 10 मिनट के अंतराल के साथ शून्य से 50 मिनट के लिए आंतरायिक वैक्यूम उपचार दें। वैक्यूम उपचार के बाद, समाशोधन समाधान को बदलें। बीजों को साफ करने की सुविधा के लिए, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को कमरे के तापमान पर 30 मिनट से सात दिनों के लिए प्रकाश से सुरक्षित रखें।देर से भ्रूण के मामले में, समाधान को एक ताजा समाशोधन समाधान के साथ दैनिक रूप से बदलें, इसके बाद बीज को 10 मिनट के लिए वैक्यूम उपचार के अधीन करें। साफ बीजों को स्लाइड या एकल अवतल स्लाइड पर रखें। डिजिटल कैमरे से लैस डीआईसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय में संचारित प्रकाश चमक, डीआईसी स्लाइडर और कंडेनसर एपर्चर को समायोजित और अनुकूलित करें और छवि को कैप्चर करें।एस.लाइकोपर्सिकम के बीजों को साफ़ करने की पारंपरिक विधि में, घने एंडोस्पर्म कोशिकाओं ने 3 और 6 डीएएफ पर शुरुआती भ्रूण के विज़ुअलाइज़ेशन को अवरुद्ध कर दिया। बीज के विकास के दौरान कम पारगम्यता के परिणामस्वरूप 9 डीएएफ के बाद फजी छवियां सामने आईं। बीज म्यूसिलेज और बीज कोट धीरे-धीरे सघन हो गए, जिससे 13 डीएएफ से क्लियरिंग एजेंटों के प्रवेश को रोका गया।सात दिनों के विस्तारित उपचार समय के बावजूद, 14 से 19 डीएएफ बीजों के अंदर भ्रूण की रूपरेखा बेहद धुंधली थी। 22 डीएएफ बीजों में आंतरिक संरचना पूरी तरह से अदृश्य थी। बीज कोट एपिडर्मल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित छीना हुआ बीज कोट म्यूसिलेज 13 डीएएफ के बाद से प्रमुख था।सोडियम हाइपोक्लोराइट उपचार ने आंतरिक बीज कोट की स्पष्ट पहचान और बीज क्षति के बिना अधिकांश अनुयायियों के म्यूसिलेज की टुकड़ी को सक्षम किया। अनुकूलित समाशोधन प्रोटोकॉल में बीजों ने सभी परीक्षण किए गए विकास चरणों में संतोषजनक पारदर्शिता दिखाई। 3 डीएएफ पर बीज कोट की अलग-अलग कोशिका परतें, 5 डीएएफ पर अलग-अलग एंडोस्पर्म कोशिकाएं, सात डीएएफ पर छड़ी के आकार का भ्रूण, 9 डीएएफ पर गोलाकार चरण और 11 डीएएफ पर हृदय चरण देखा गया।अनुकूलित प्रोटोकॉल में, भ्रूण के विकास के विभिन्न चरणों में कोटिलेडोन और शूट एपिकल मेरिस्टेम के कर्ल की डिग्री बहुत आसानी से कैप्चर की गई थी। नसबंदी बीज म्यूसिलेज और बीज कोट वर्णक को हटा देती है, जो बीज प्रवेश और विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाती है। वैक्यूम उपचार समाधान प्रवेश को साफ़ करने में तेजी ला सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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प्राथमिक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए चिकी retinas में कुशल जीन स्थानांतरण: एक<em&gt; पूर्व ओवो</em&gt; Electroporation दृष्टिकोण

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

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एक का विकास<em&gt; इन विट्रो</em&gt; परख mesenchymal कोशिकाओं कि कराना पड़ा उपकला-mesenchymal संक्रमण की सिकुड़ा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic लिवर मॉडल के विकास का अध्ययन करने के पूर्वज सेल की मध्यस्थता Hepatocyte पुनर्जनन

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

सेल वंश मार्करों के सह स्थानीयकरण और टमाटर सिग्नल

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic संस्कृति विधि भ्रूण चिकन ऊतकों के विकास का अध्ययन करने के लिए

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

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Vivo में एक विधि माउस रक्त-वृषण बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण के भीतर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरएनए इन-सीटू वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

माउस में डिम्बग्रंथि रिजर्व के विकासशील डिम्बग्रंथि रिजर्व के मात्रात्मक 3 डी विश्लेषण के लिए पूरे अंडाशय Immunofluorescence, समाशोधन, और Multiphoton माइक्रोस्कोपी