Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Gli autori sono grati al Dr. Jie Le e al Dr. Xiufen Song per i loro utili suggerimenti sulla microscopia a contrasto di interferenza differenziale e sul metodo di compensazione convenzionale, rispettivamente. Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31870299) e dalla Youth Innovation Promotion Association dell'Accademia cinese delle scienze. La Figura 2 è stata creata con BioRender.com.

1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare il fissativo FAA aggiungendo 2,5 ml di formaldeide al 37%, 2,5 ml di acido acetico glaciale e 45 ml di etanolo al 70% in una provetta da centrifuga da 50 ml. Vortex e conservarlo a 4 °C. Preparare il fissativo FAA appena prima dell'uso. ATTENZIONE: il 37% di formaldeide è corrosivo e potenzialmente cancerogeno se esposto o inalato. Il fissativo deve essere eseguito in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale.</...

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	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

Rispetto al sezionamento meccanico, la tecnologia di compensazione è più vantaggiosa per l'imaging tridimensionale in quanto mantiene l'integrità dei tessuti vegetali o degli organi16. I protocolli di pulizia convenzionali sono spesso limitati a piccoli campioni a causa della più facile penetrazione delle soluzioni chimiche. Il seme di pomodoro è un campione problematico per la pulizia dei tessuti perché è circa 70 volte più grande di un seme di Arabidopsis in termini di dimension...

Il pomodoro (S. lycopersicum L.) è una delle colture orticole più importanti in tutto il mondo, con una produzione di 186,8 milioni di tonnellate di frutti carnosi da 5,1 milioni di ettari nel 20201. Appartiene alla grande famiglia delle Solanacee con circa 2.716 specie2, tra cui molte colture commercialmente importanti come melanzane, peperoni, patate e tabacco. Il pomodoro coltivato è una specie diploide (2n = 2x = 24) con una dimensione del genoma di circa 900 Mb3. Per molto tempo, sono stati fatti grandi sforzi verso l'addomesticamento e l'allevamento del pomodoro selezionando tratti desiderabili da Solanum spp selvatico. Ci sono oltre 5.000 accessioni di pomodoro elencate nel Tomato Genetics Resource Center e più di 80.000 germoplasma di pomodori sono conservati in tutto il mondo4. La pianta di pomodoro è perenne nella serra e si propaga per semi. Un seme di pomodoro maturo è costituito da tre compartimenti principali: un embrione adulto, un endosperma di tipo cellulare residuo e un rivestimento di semi duri 5,6 (Figura 1A). Dopo la doppia fecondazione, lo sviluppo dell'endosperma di tipo cellulare precede lo sviluppo degli zigoti. A ~ 5-6 giorni dopo la fioritura (DAF), il proembrione bicellulare viene osservato per la prima volta quando l'endosperma è costituito da sei a otto nuclei7. In Solanum pimpinellifolium, l'embrione si avvicina alla sua dimensione finale dopo 20 DAF e i semi sono vitali per la germinazione dopo 32 DAF8. Man mano che l'embrione si sviluppa, l'endosperma viene gradualmente assorbito e solo una piccola quantità di endosperma rimane nel seme. L'endosperma residuo è costituito da endosperma micropilare che circonda la punta della radicola, e endosperma laterale nel resto del seme 9,10. Il rivestimento esterno del seme è sviluppato dall'epidermide esterna ispessita e lignificata del tegumento e, con gli strati morti dei resti di tegumento, formano un guscio duro per proteggere l'embrione e l'endosperma5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica di un seme maturo in Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinale di un seme di pomodoro maturo. (B) Anatomia longitudinale di un seme maturo di Arabidopsis. Un seme di pomodoro maturo è circa 70 volte più grande di un seme di Arabidopsis. Barre della scala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
La produzione di semi di pomodoro di alta qualità dipende dalla coordinazione tra l'embrione, l'endosperma e i componenti materni del seme11. La dissezione di geni e reti chiave nello sviluppo dei semi richiede una registrazione fenotipica profonda e completa dei semi mutanti. Le tecniche convenzionali di embedding-sectioning, come la sezione semisottile e la sezione paraffina, sono ampiamente applicate ai semi di pomodoro per osservare le strutture locali e più fini dell'embrione12,13,14,15. Tuttavia, l'analisi dello sviluppo del seme da sezioni sottili è solitamente laboriosa e manca di risoluzione spaziale dell'asse z. In confronto, la pulizia dei tessuti è un metodo rapido ed efficiente per individuare la fase di sviluppo dei difetti embrionali che hanno maggiori probabilità di verificarsi16. Il metodo di compensazione riduce l'opacità del tessuto interno omogeneizzando l'indice di rifrazione con uno o più agenti biochimici16. La pulizia dell'intero tessuto consente l'osservazione di una struttura di tessuto vegetale senza distruggerne l'integrità e la combinazione di tecnologia di clearing e imaging tridimensionale è diventata una soluzione ideale per ottenere informazioni sulla morfologia e sullo stato di sviluppo di un organo vegetale17,18. Nel corso degli anni, le tecniche di disboscamento dei semi sono state utilizzate in varie specie vegetali, tra cui Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Tra questi, la tecnologia di eliminazione degli ovuli a montaggio intero è stata un approccio efficiente per studiare lo sviluppo dei semi di Arabidopsis, grazie alle sue piccole dimensioni, 4-5 strati della cellula del rivestimento del seme e l'endosperma di tipo nucleare24,25. Con il continuo aggiornamento di diverse miscele di compensazione, come l'emergere della soluzione26 di Hoyer, le strutture interne dell'ovulo d'orzo sono state visualizzate con un alto grado di chiarezza, sebbene il suo endosperma costituisca la maggior parte dei semi. L'embriogenesi della barbabietola da zucchero può essere osservata mediante pulizia combinata con trattamento sottovuoto e ammorbidimento con acido cloridrico19. Tuttavia, a differenza delle specie sopra menzionate, non sono state riportate osservazioni embriologiche mediante protocolli di eliminazione nei semi di pomodoro. Ciò impedisce un'indagine dettagliata sullo sviluppo embrionale e delle sementi dei pomodori.
L'idrato di cloralio è comunemente usato come soluzione di compensazione che consente ai tessuti e alle cellule immersi di essere visualizzati su diversi piani ottici e preserva sostanzialmente le cellule o i componenti tissutali27,28,29. Il protocollo di clearing a base di cloralio idrato è stato utilizzato con successo per la pulizia completa dei semi per osservare l'embrione e l'endosperma di Arabidopsis21,28. Tuttavia, questa soluzione di compensazione non è efficiente nella pulizia dei semi di pomodoro, che sono più impermeabili dei semi di Arabidopsis. Le barriere fisiche includono: (1) il tegumento del pomodoro ha quasi 20 strati cellulari da 3 a 15 DAF 30,31, (2) l'endosperma del pomodoro è di tipo cellulare, non di tipo nucleare 32, e (3) i semi di pomodoro sono circa 70 volte più grandi in termini di dimensioni33,34 e (4) producono grandi quantità di mucillagine del rivestimento del seme, che blocca la penetrazione dei reagenti di compensazione e influenza la visualizzazione delle cellule embrionali.
Pertanto, questo rapporto presenta un metodo di pulizia ottimizzato a base di idrato di cloralio per la pulizia a montaggio intero dei semi di pomodoro in diverse fasi, che consente l'imaging profondo del processo di sviluppo dell'embrione (Figura 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

Il pomodoro (Solanum lycopersicum L.) è una delle principali colture commerciali in tutto il mondo. Il seme di pomodoro è un modello importante per lo studio della genetica e della biologia dello sviluppo durante la riproduzione delle piante. La visualizzazione della struttura embrionale più fine all'interno di un seme di pomodoro è spesso ostacolata dalla mucillagine del rivestimento del seme, dal tegumento multicellulare e da un endosperma a parete spessa, che deve essere risolto con un laborioso sezionamento di incorporamento. Un'alternativa più semplice è quella di impiegare tecniche di pulizia dei tessuti che rendono il seme quasi trasparente usando agenti chimici. Sebbene le procedure di pulizia convenzionali consentano una visione approfondita dei semi più piccoli con un rivestimento di semi più sottile, la pulizia dei semi di pomodoro continua ad essere tecnicamente impegnativa, specialmente nelle ultime fasi di sviluppo.
Qui viene presentato un protocollo di pulizia rapido e laborioso per osservare lo sviluppo dei semi di pomodoro da 3 a 23 giorni dopo la fioritura, quando la morfologia embrionale è quasi completa. Questo metodo combina la soluzione di compensazione a base di cloralio idrato ampiamente utilizzata in Arabidopsis con altre modifiche, tra cui l'omissione della fissazione formalina-aceto-alcol (FAA), l'aggiunta di trattamento ipoclorito di sodio dei semi, la rimozione della mucillagine ammorbidita del rivestimento del seme e il lavaggio e il trattamento sottovuoto. Questo metodo può essere applicato per una pulizia efficiente dei semi di pomodoro in diverse fasi di sviluppo ed è utile nel monitoraggio completo del processo di sviluppo dei semi mutanti con una buona risoluzione spaziale. Questo protocollo di compensazione può anche essere applicato all'imaging profondo di altre specie commercialmente importanti nelle Solanaceae.

Quando i semi di pomodoro sono stati eliminati utilizzando un metodo convenzionale come in Arabidopsis, le cellule endospermatiche dense hanno bloccato la visualizzazione dei primi embrioni di pomodoro a 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A, B). Con l'aumentare del volume totale dell'embrione, un embrione globulare era appena distinguibile a 9 DAF (Figura 3C). Tuttavia, poiché la dimensione del seme ha continuato ad aumentare, la sua permeabilità...

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An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

Il seme di pomodoro è un modello importante per lo studio della genetica e della biologia dello sviluppo durante la riproduzione delle piante. Questo protocollo è utile per eliminare i semi di pomodoro nelle diverse fasi di sviluppo per osservare la struttura embrionale più fine.

Un protocollo di compensazione efficace per lo studio dello sviluppo delle sementi nel pomodoro (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Questo metodo può aiutare le ricerche a trovare rapidamente e senza sforzo periodi anormali di sviluppo dell'embrione di pomodoro. Il principale vantaggio di questo protocollo è un trattamento dei semi di pomodoro con ipoclorito di sodio che fornisce una base per l'osservazione degli embrioni di pomodoro. Inizia con la preparazione chimica e la raccolta dei frutti di Solanum lycopersicum da tre a 23 giorni dopo la fioritura o DAF.Metti immediatamente i frutti sul ghiaccio e dividili in frutti precoci, medi e tardivi, in base ai giorni successivi alla fioritura. Rompere il frutto precoce, metterlo su un vetrino e raccogliere i semi freschi con cura con una pinza di precisione con ingrandimento da 1x a 4x del microscopio stereo. Per i frutti medi e tardivi, rompere il frutto e raccogliere direttamente i semi freschi usando una pinza di precisione.Nel metodo convenzionale, trasferire immediatamente i semi appena raccolti in un tubo di centrifuga da due millilitri contenente fissativo FAA da 1,5 millilitri e posizionare il tubo sullo shaker orbitale a 5 giri / min per quattro ore a temperatura ambiente. Quindi disidratare i semi in etanolo al 70% 95% e 100% per un'ora ciascuno su uno shaker orbitale a 5 giri / min. Una volta fatto, posizionare il seme nelle tre-cinque gocce di soluzione trasparente presente sul vetrino e coprirlo delicatamente con un vetrino di copertura.Utilizzare una singola diapositiva concava per semi medi e tardivi. A seconda delle fasi di sviluppo dei semi, incubarli a temperatura ambiente per la pulizia. Dopo l'incubazione, osservare i campioni con un contrasto di interferenza differenziale, o microscopio DIC dotato di una fotocamera digitale con ingrandimento 10x, 20x e 40x.Regola e ottimizza la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e acquisisci immagini. Trasferire i semi freschi raccolti dai frutti rotti in un tubo da centrifuga da due millilitri contenente 1,5 millilitri di soluzione disinfettante. Incubare i campioni su uno shaker orbitale a 30 giri / min per tre a 50 minuti a temperatura ambiente.Una volta che il contorno del rivestimento più interno del seme è chiaramente visibile, scartare la soluzione disinfettante. Per i semi medi e tardivi, trasferire i semi su un vetrino. Utilizzare una pinza e un ago da dissezione per rimuovere la mucillagine del seme con un ingrandimento da 1x a 4x del microscopio stereo.Trasferire nuovamente i semi nel tubo della centrifuga originale usando una pinza. Lavarli cinque volte in 1,5 millilitri di acqua deionizzata per 10 secondi ciascuno e scartare l'acqua deionizzata. Quindi, aggiungere il doppio volume della soluzione di compensazione ai semi.A seconda della fase di semina, somministrare il trattamento sottovuoto intermittente da zero a 50 minuti, con intervalli di 10 minuti dopo ogni trattamento sottovuoto di 10 minuti. Dopo il trattamento sottovuoto, sostituire la soluzione di pulizia. Per facilitare la rimozione dei semi, posizionare il tubo della centrifuga protetto dalla luce per 30 minuti a sette giorni a temperatura ambiente.Nel caso di embrioni tardivi, sostituire la soluzione ogni giorno con una soluzione di pulizia fresca, seguita da sottoporre i semi a trattamento sottovuoto per 10 minuti. Posizionare i semi eliminati sul vetrino o sul singolo vetrino concavo. Utilizzando il microscopio DIC dotato di una fotocamera digitale, regolare e ottimizzare la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e catturare l'immagine.Nel metodo convenzionale di eliminazione dei semi di S.lycopersicum, le dense cellule endospermatiche hanno bloccato la visualizzazione dei primi embrioni a 3 e 6 DAF. La diminuzione della permeabilità durante la crescita del seme ha portato a immagini sfocate dopo 9 DAF. La mucillagine e il rivestimento del seme sono diventati gradualmente più densi, impedendo la penetrazione degli agenti chiarificatori dal 13 DAF in poi.Il contorno dell'embrione all'interno di 14-19 semi DAF era estremamente sfocato, nonostante il lungo tempo di trattamento di sette giorni. La struttura interna di 22 sementi DAF era completamente invisibile. La mucillagine del rivestimento del seme spogliato prodotta dalle cellule epidermiche del rivestimento del seme era prominente dal 13 DAF in poi.Il trattamento con ipoclorito di sodio ha permesso una chiara identificazione del rivestimento interno del seme e il distacco della maggior parte della mucillagine aderente senza danni ai semi. Nel protocollo di compensazione ottimizzato i semi hanno mostrato una trasparenza soddisfacente in tutte le fasi di sviluppo testate. Sono stati osservati gli strati cellulari distinti del rivestimento del seme a 3 DAF, le cellule endospermatiche distinguibili a 5 DAF, l'embrione a forma di bastoncino a sette DAF, lo stadio globulare a 9 DAF e lo stadio cardiaco a 11 DAF.Nel protocollo ottimizzato, il grado del ricciolo di cotiledoni e meristema apicale di tiro è stato catturato molto facilmente in varie fasi dello sviluppo embrionale. La sterilizzazione rimuove la mucillagine dei semi e il pigmento del rivestimento del seme, che migliorano la penetrazione e la visualizzazione dei semi. Il trattamento sotto vuoto può accelerare la penetrazione della soluzione di pulizia.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elettroporazione Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-localizzazione di marcatori di cellule lignaggio e il segnale di pomodoro

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