Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Os autores são gratos ao Dr. Jie Le e ao Dr. Xiufen Song por suas sugestões úteis sobre microscopia de contraste de interferência diferencial e método de limpeza convencional, respectivamente. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31870299) e pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil da Academia Chinesa de Ciências. A Figura 2 foi criada com BioRender.com.

1. Preparação de soluções
<ol><li>Preparar o fixador de FAA adicionando 2,5 mL de formaldeído a 37%, 2,5 mL de ácido acético glacial e 45 mL de etanol a 70% em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo a 4 °C. Prepare recentemente o fixador FAA imediatamente antes de usar. CUIDADO: 37% de formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno se exposto ou inalado. O fixador deve ser realizado em um exaustor enquanto estiver usando o equipamento de proteção individual apro...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

Em comparação com o corte mecânico, a tecnologia de limpeza é mais vantajosa para imagens tridimensionais, pois mantém a integridade dos tecidos ou órgãos vegetais16. Os protocolos de limpeza convencionais são frequentemente limitados a pequenas amostras devido à penetração mais fácil de soluções químicas. A semente de tomate é uma amostra problemática para a limpeza de tecidos porque é cerca de 70 vezes maior do que uma semente de Arabidopsis em tamanho e tem mais barre...

O tomate (S. lycopersicum L.) é uma das culturas vegetais mais importantes do mundo, com uma produção de 186,8 milhões de toneladas de frutos carnudos de 5,1 milhões de hectares em 20201. Pertence à grande família Solanaceae com cerca de 2.716 espécies2, incluindo muitas culturas comercialmente importantes, como berinjela, pimenta, batata e tabaco. O tomateiro cultivado é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) com um tamanho de genoma de aproximadamente 900 Mb3. Durante muito tempo, um grande esforço tem sido feito para a domesticação e reprodução do tomate, selecionando características desejáveis de Solanum spp selvagem. Existem mais de 5.000 acessos de tomate listados no Tomato Genetics Resource Center e mais de 80.000 germoplasma de tomates são armazenados em todo o mundo4. A planta de tomate é perene na estufa e se propaga por sementes. Uma semente de tomate madura consiste em três compartimentos principais: um embrião adulto, endosperma residual do tipo celular e um revestimento de sementes duras 5,6 (Figura 1A). Após a dupla fertilização, o desenvolvimento de endospermas do tipo celular precede o desenvolvimento de zigotos. Em ~5-6 dias após a floração (DAF), o proembrião de duas células é observado pela primeira vez quando o endosperma consiste de seis a oito núcleos7. Em Solanum pimpinellifolium, o embrião se aproxima de seu tamanho final após 20 DAF, e as sementes são viáveis para germinação após 32 DAF8. À medida que o embrião se desenvolve, o endosperma é gradualmente absorvido e apenas uma pequena quantidade de endosperma permanece na semente. O endosperma residual consiste em endosperma micropilar ao redor da ponta da radícula e endosperma lateral no restante da semente 9,10. O revestimento externo da semente é desenvolvido a partir da epiderme externa espessada e lignificada do tegumento e, com as camadas mortas de restos de tegumento, formam uma casca dura para proteger o embrião e o endosperma5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática de uma semente madura em Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinal de uma semente de tomateiro madura. (B) Anatomia longitudinal de uma semente madura de Arabidopsis. Uma semente de tomate madura é aproximadamente 70 vezes maior em tamanho do que uma semente de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A produção de sementes de tomate de alta qualidade depende da coordenação entre o embrião, o endosperma e os componentes maternos das sementes11. Dissecar genes-chave e redes no desenvolvimento de sementes requer um registro fenotípico profundo e completo de sementes mutantes. Técnicas convencionais de embutimento-seccionamento, como a seção semifina e a seção de parafina, são amplamente aplicadas às sementes de tomateiro para observar as estruturas locais e mais finas do embrião12,13,14,15. No entanto, a análise do desenvolvimento de sementes a partir de seções finas é geralmente trabalhosa e carece de resolução espacial do eixo z. Em comparação, a depuração tecidual é um método rápido e eficiente para identificar o estágio de desenvolvimento dos defeitos embrionários com maior probabilidade de ocorrer16. O método de clareamento reduz a opacidade do tecido interno homogeneizando o índice de refração com um ou mais agentes bioquímicos16. A limpeza de tecidos inteiros permite a observação de uma estrutura tecidual vegetal sem destruir sua integridade, e a combinação de tecnologia de clareamento e imagens tridimensionais tornou-se uma solução ideal para obter informações sobre a morfologia e o estado de desenvolvimento de um órgão vegetal17,18. Ao longo dos anos, técnicas de limpeza de sementes têm sido utilizadas em várias espécies vegetais, incluindo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris19,20,21,22,23. Dentre estas, a tecnologia de limpeza de óvulos de montagem completa tem sido uma abordagem eficiente para o estudo do desenvolvimento de sementes de Arabidopsis, devido ao seu pequeno tamanho, 4-5 camadas da célula do revestimento da semente e o endosperma do tipo nuclear24,25. Com a atualização contínua de diferentes misturas de clareamento, como o surgimento da solução de Hoyer26, as estruturas internas do óvulo de cevada foram fotografadas com alto grau de clareza, embora seu endosperma constitua a maior parte das sementes. A embriogênese da beterraba sacarina pode ser observada por limpeza combinada com tratamento a vácuo e amolecimento com ácido clorídrico19. No entanto, ao contrário das espécies mencionadas acima, observações embriológicas por protocolos de limpeza em sementes de tomate não foram relatadas. Isso evita uma investigação detalhada sobre o desenvolvimento embrionário e de sementes de tomates.
O hidrato de cloral é comumente utilizado como solução de clareamento que permite que os tecidos e células imersos sejam exibidos em diferentes planos ópticos, preserva substancialmente as células ou componentes teciduais27,28,29. O protocolo de clareamento à base de hidrato de cloral tem sido utilizado com sucesso para a limpeza completa de sementes para observar o embrião e o endosperma de Arabidopsis21,28. No entanto, esta solução de limpeza não é eficiente na limpeza de sementes de tomate, que são mais impermeáveis do que as sementes de Arabidopsis. As barreiras físicas incluem: (1) o tegumento do tomate tem quase 20 camadas celulares em 3 a 15 DAF 30,31, (2) o endosperma do tomate é do tipo celular, não do tipo nuclear 32, e (3) as sementes de tomate são cerca de 70 vezes maiores em tamanho33,34 e (4) produzem grandes quantidades de mucilagem do revestimento da semente, o que bloqueia a penetração de reagentes de limpeza e afeta a visualização das células embrionárias.
Portanto, este relato apresenta um método otimizado de clareamento à base de hidrato de cloral para limpeza integral de sementes de tomateiro em diferentes estágios, o que permite imagens profundas do processo de desenvolvimento embrionário (Figura 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais culturas comerciais em todo o mundo. A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. A visualização da estrutura embrionária mais fina dentro de uma semente de tomate é muitas vezes dificultada pela mucilagem do revestimento da semente, tegumento em camadas multicelulares e um endosperma de paredes espessas, que precisa ser resolvido por uma laboriosa seção de incorporação. Uma alternativa mais simples é empregar técnicas de limpeza de tecidos que tornam a semente quase transparente usando agentes químicos. Embora os procedimentos convencionais de limpeza permitam uma visão profunda de sementes menores com um revestimento de sementes mais fino, a limpeza de sementes de tomate continua a ser tecnicamente desafiadora, especialmente nos estágios finais de desenvolvimento.
Apresentamos aqui um protocolo de limpeza rápido e que economiza trabalho para observar o desenvolvimento de sementes de tomate de 3 a 23 dias após a floração, quando a morfologia embrionária está quase completa. Este método combina solução de limpeza à base de hidrato de cloral amplamente utilizada em Arabidopsis com outras modificações, incluindo a omissão de fixação de formalina-aceto-álcool (FAA), a adição de tratamento de hipoclorito de sódio de sementes, remoção da mucilagem de revestimento de sementes amolecida e lavagem e tratamento a vácuo. Este método pode ser aplicado para a limpeza eficiente de sementes de tomateiro em diferentes estágios de desenvolvimento e é útil no monitoramento completo do processo de desenvolvimento de sementes mutantes com boa resolução espacial. Este protocolo de limpeza também pode ser aplicado a imagens profundas de outras espécies comercialmente importantes nas Solanaceae.

Quando as sementes de tomate foram limpas usando um método convencional como em Arabidopsis, os densos nódulos endospermáticos bloquearam a visualização de embriões de tomate precoces em 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A,B). À medida que o volume total do embrião aumentava, um embrião globular era quase indistinguível a 9 DAF (Figura 3C). No entanto, à medida que o tamanho da semente continuou a aumentar, sua permeabilidade diminuiu, ...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. Este protocolo é útil para a limpeza de sementes de tomate em diferentes estágios de desenvolvimento para observar a estrutura embrionária mais fina.

Um Protocolo de Limpeza Eficiente para o Estudo do Desenvolvimento de Sementes em Tomateiro (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Este método pode ajudar as pesquisas a encontrar rapidamente e sem esforço períodos anormais de desenvolvimento embrionário de tomate. A principal vantagem deste protocolo é o tratamento de sementes de tomate com hipoclorito de sódio que fornece uma base para a observação de embriões de tomate. Comece com a preparação química e colheita dos frutos de Solanum lycopersicum três a 23 dias após a floração ou DAF.Coloque imediatamente os frutos no gelo e divida-os em frutos precoces, médios e tardios, com base nos dias após a floração. Quebre a fruta precoce, coloque-a em uma lâmina e colete cuidadosamente as sementes frescas com pinças de precisão sob ampliação de 1x a 4x do microscópio estéreo. Para frutos médios e tardios, quebre os frutos e colete diretamente sementes frescas usando pinça de precisão.No método convencional, transfira as sementes recém-coletadas imediatamente para um tubo de centrífuga de dois mililitros contendo fixador FAA de 1,5 mililitros e coloque o tubo no agitador orbital a 5 rpm por quatro horas à temperatura ambiente. Em seguida, desidrate as sementes em 70%95% e 100% de etanol por uma hora cada em um agitador orbital a 5 rpm. Uma vez feito, coloque a semente nas três a cinco gotas de solução de limpeza presentes na lâmina e cubra-a suavemente com um deslizamento de cobertura.Use uma única lâmina côncava para sementes médias e tardias. Dependendo dos estágios de desenvolvimento das sementes, incube-as à temperatura ambiente para limpeza. Após a incubação, observe as amostras com um contraste de interferência diferencial, ou microscópio DIC equipado com uma câmera digital na ampliação de 10x, 20x e 40x.Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens. Transfira as sementes frescas coletadas dos frutos quebrados para um tubo de centrífuga de dois mililitros contendo 1,5 mililitros de solução desinfetante. Incubar as amostras num agitador orbital a 30 rpm durante três a 50 minutos à temperatura ambiente.Uma vez que o contorno do revestimento da semente mais interno esteja claramente visível, descarte a solução desinfetante. Para sementes médias e tardias, transfira as sementes para uma lâmina. Use fórceps e uma agulha dissecante para remover a mucilagem da semente sob ampliação de 1x a 4x do microscópio estéreo.Transfira as sementes de volta para o tubo de centrífuga original usando pinças. Lave-os cinco vezes em 1,5 mililitros de água deionizada por 10 segundos cada e descarte a água deionizada. Em seguida, adicione o volume duplo da solução de limpeza às sementes.Dependendo do estágio da semente, dê o tratamento a vácuo intermitente por zero a 50 minutos, com intervalos de 10 minutos após cada tratamento a vácuo de 10 minutos. Após o tratamento a vácuo, substitua a solução de limpeza. Para facilitar a limpeza das sementes, coloque o tubo de centrífuga protegido da luz por 30 minutos a sete dias à temperatura ambiente.No caso de embriões tardios, substitua a solução diariamente por uma solução de limpeza fresca, seguida de submeter as sementes a tratamento a vácuo por 10 minutos. Coloque as sementes limpas na lâmina ou na lâmina côncava única. Usando o microscópio DIC equipado com uma câmera digital, ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture a imagem.No método convencional de limpeza de sementes de S.lycopersicum, os densos endospermas bloquearam a visualização de embriões precoces a 3 e 6 DAF. A diminuição da permeabilidade durante o crescimento das sementes resultou em imagens difusas após 9 DAF. A mucilagem e o revestimento das sementes tornaram-se gradualmente mais densos, impedindo a penetração de agentes de limpeza a partir de 13 DAF.O contorno do embrião dentro de 14 a 19 sementes DAF foi extremamente borrado, apesar do tempo de tratamento prolongado de sete dias. A estrutura interna em 22 sementes DAF era completamente invisível. A mucilagem do revestimento da semente despojada produzida pelas células epidérmicas do revestimento da semente foi proeminente a partir de 13 DAF.O tratamento com hipoclorito de sódio possibilitou a identificação clara do revestimento interno da semente e o descolamento da maior parte da mucilagem aderente sem danos às sementes. No protocolo de clareamento otimizado as sementes apresentaram transparência satisfatória em todas as etapas de desenvolvimento testadas. Foram observadas as distintas camadas celulares do revestimento da semente a 3 DAF, os endospermócitos distinguíveis a 5 DAF, o embrião em forma de bastão a sete DAF, o estágio globular a 9 DAF e o estágio cardíaco a 11 DAF.No protocolo otimizado, o grau de ondulação dos cotilédones e do meristema apical da parte aérea foi muito facilmente capturado em vários estágios do desenvolvimento embrionário. A esterilização remove a mucilagem das sementes e o pigmento do revestimento das sementes, que aumentam a penetração e a visualização das sementes. O tratamento a vácuo pode acelerar a penetração da solução de limpeza.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse