Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Авторы благодарны доктору Цзе Ле и доктору Сюфэнь Сун за их полезные предложения по дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии и традиционному методу очистки соответственно. Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31870299) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи Китайской академии наук. Рисунок 2 был создан с помощью BioRender.com.

1. Приготовление растворов
<ol><li>Приготовьте фиксатор FAA, добавив 2,5 мл 37% формальдегида, 2,5 мл ледниковой уксусной кислоты и 45 мл 70% этанола в 50 мл центрифужной трубки. Вихрь и храните его при 4 °C. Только что приготовьте фиксатор FAA непосредственно перед использованием. ВНИМАНИЕ:...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

По сравнению с механическим сечением, технология очистки более выгодна для трехмерной визуализации, поскольку она сохраняет целостность растительных тканей или органов16. Обычные протоколы очистки часто ограничиваются небольшими образцами из-за более легкого проникнове...

Томат (S. lycopersicum L.) является одной из важнейших овощных культур во всем мире, с объемом производства 186,8 млн. тонн мясистых фруктов с 5,1 млн. га в 2020 году1. Он принадлежит к большому семейству пасленовых, насчитывающему около 2 716 видов2, включая многие коммерчески важные культуры, такие как баклажаны, перец, картофель и табак. Культивируемый помидор является диплоидным видом (2n = 2x = 24) с размером генома около 900 Mb3. В течение долгого времени были приложены большие усилия для одомашнивания и селекции томатов путем отбора желаемых признаков из дикого Solanum spp. В Центре генетических ресурсов томатов зарегистрировано более 5000 томатов, и во всем мире хранится более 80 000 зародышевой плазмы помидоров4. Растение томат является многолетним в теплице и размножается семенами. Зрелое семя томата состоит из трех основных отсеков: полноценного эмбриона, остаточного эндосперма клеточного типа и твердой семенной оболочки 5,6 (рисунок 1А). После двойного оплодотворения развитию эндосперма клеточного типа предшествует развитие зигот. Через ~5-6 дней после цветения (DAF) впервые наблюдается двухклеточное проэмбрио, когда эндосперм состоит из шести-восьми ядер7. В Solanum pimpinellifolium эмбрион приближается к своему окончательному размеру после 20 DAF, а семена жизнеспособны для прорастания после 32 DAF8. По мере развития эмбриона эндосперм постепенно всасывается и в семени остается лишь небольшое количество эндосперма. Остаточный эндосперм состоит из микропирлярного эндосперма, окружающего кончик радика, и бокового эндосперма в остальной части семени 9,10. Наружная семенная оболочка развивается из утолщенного и одревесного наружного эпидермиса покрова, а с отмершими слоями остатков покрова они образуют твердую оболочку для защиты эмбриона и эндосперма5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение зрелого семени у Solanum lycopersicum и Arabidopsis thaliana. (A) Продольная анатомия зрелого семени томата. (B) Продольная анатомия зрелого семени Arabidopsis . Зрелое семя помидора примерно в 70 раз больше по размеру, чем семя арабидопсиса . Шкала = (A) 400 мкм, (B) 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Производство высококачественных семян томатов зависит от координации между компонентами эмбриона, эндосперма и материнского семенного компонента11. Препарирование ключевых генов и сетей в развитии семян требует глубокой и полной фенотипической регистрации мутантных семян. Традиционные методы встраивания-сечения, такие как полутонкое сечение и парафиновое сечение, широко применяются к семенам томатов для наблюдения за местными и более тонкими структурами эмбриона 12,13,14,15. Однако анализ развития семян из тонких участков обычно трудоемкий и не имеет пространственного разрешения по оси Z. Для сравнения, очистка тканей является быстрым и эффективным методом для точного определения стадии развития дефектов эмбриона, которые, скорее всего, произойдут16. Способ очистки уменьшает непрозрачность внутренней ткани путем гомогенизации показателя преломления одним или несколькими биохимическими агентами16. Очистка всей ткани позволяет наблюдать структуру растительной ткани, не разрушая ее целостность, а сочетание технологии очистки и трехмерной визуализации стало идеальным решением для получения информации о морфологии и состоянии развития растительного органа17,18. На протяжении многих лет методы очистки семян использовались у различных видов растений, включая Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare и Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Среди них технология очистки яйцеклеток с цельной горой была эффективным подходом к изучению развития семян Arabidopsis, благодаря его небольшому размеру, 4-5 слоям клетки семенной оболочки и эндосперму ядерного типа24,25. При постоянном обновлении различных очищающих смесей, таких как появление раствораХойера 26, внутренние структуры яйцеклетки ячменя были изображены с высокой степенью прозрачности, хотя ее эндосперм составляет основную часть семян. Эмбриогенез сахарной свеклы можно наблюдать путем очистки в сочетании с вакуумной обработкой и размягчения соляной кислотой19. Тем не менее, в отличие от видов, упомянутых выше, об эмбриологических наблюдениях путем очистки протоколов в семенах томатов не сообщалось. Это препятствует детальному исследованию эмбрионального и семенного развития томатов.
Хлоралгидрат обычно используется в качестве очищающего раствора, который позволяет погружаться тканям и клеткам отображаться на различных оптических плоскостях и по существу сохраняет клетки или тканевые компоненты 27,28,29. Протокол очистки на основе хлоралгидрата был успешно использован для очистки семян по всей установке для наблюдения за зародышем и эндоспермом Arabidopsis 21,28. Однако этот очистительный раствор не эффективен при очистке семян томатов, которые более непроницаемы, чем семена арабидопсиса. Физические барьеры включают: (1) кожный покров томата имеет почти 20 клеточных слоев при 3-15 DAF30,31, (2) эндосперм томата клеточного типа, а не ядерного типа32, и (3) семена томатов примерно в 70 раз больше поразмеру 33,34 и (4) производят большое количество слизи семенной оболочки, что блокирует проникновение очищающих реагентов и влияет на визуализацию эмбриональных клеток.
Таким образом, в настоящем отчете представлен оптимизированный метод очистки на основе хлоралгидрата для полной очистки семян томатов на разных стадиях, который позволяет глубоко визуализировать процесс развития эмбриона (рисунок 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

Помидор (Solanum lycopersicum L.) является одной из основных товарных культур во всем мире. Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Визуализация более тонкой эмбриональной структуры внутри семени томата часто затруднена слизистой оболочкой семян, многоклеточным слоистым покровом и толстостенным эндоспермом, который необходимо устранить трудоемким встраиванием-сечением. Более простой альтернативой является использование методов очистки тканей, которые делают семена почти прозрачными с помощью химических агентов. Хотя обычные процедуры очистки позволяют глубоко проникнуть в более мелкие семена с более тонкой семенной оболочкой, очистка семян томатов по-прежнему является технически сложной задачей, особенно на поздних стадиях развития.
Здесь представлен быстрый и трудосберегающий протокол очистки для наблюдения за развитием семян томатов от 3 до 23 дней после цветения, когда эмбриональная морфология почти завершена. Этот метод сочетает в себе раствор очистки на основе хлоралгидрата, широко используемый в Арабидопсисе , с другими модификациями, включая пропуск фиксации формалин-ацето-спирта (FAA), добавление обработки семян гипохлоритом натрия, удаление размягченной слизи семенной оболочки, а также промывку и вакуумную обработку. Этот метод может быть применен для эффективной очистки семян томатов на разных стадиях развития и полезен при полном мониторинге процесса развития мутантных семян с хорошим пространственным разрешением. Этот протокол очистки может также применяться для глубокой визуализации других коммерчески важных видов в Solanaceae.

Когда семена томатов очищали с использованием обычного метода, как в Arabidopsis, плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов томатов при 3 DAF и 6 DAF (рисунок 3A, B). По мере увеличения общего объема эмбриона шаровидный эмбрион был едва разли...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Этот протокол полезен для очистки семян томатов на разных стадиях развития, чтобы наблюдать более тонкую эмбриональную структуру.

Эффективный клиринговый протокол для изучения развития семян в томатах (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Этот метод может помочь исследователям быстро и без усилий найти аномальные периоды развития эмбриона томата. Основным преимуществом данного протокола является обработка семян томатов гипохлоритом натрия, который обеспечивает основу для наблюдения за эмбрионами томатов. Начните с химической подготовки и сбора плодов Solanum lycopersicum через три-23 дня после цветения или DAF.Сразу же выложить плоды на лед и разделить их на ранние, средние и поздние плоды, исходя из дней после цветения. Разбейте ранний плод, положите его на горку и тщательно соберите свежие семена с помощью точных щипцов под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа. Для средних и поздних плодов разбейте плоды и непосредственно соберите свежие семена с помощью прецизионных щипцов.В обычном методе переложите свежесобранные семена немедленно в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую фиксатор FAA 1,5 миллилитра, и поместите трубку на орбитальный шейкер при 5 оборотах в минуту в течение четырех часов при комнатной температуре. Затем обезвоживают семена в 70% 95% и 100% этаноле в течение одного часа каждый на орбитальном шейкере со скоростью 5 оборотов в минуту. После этого поместите семя в три-пять капель очищающего раствора, присутствующего на слайде, и аккуратно накройте его крышкой.Используйте один вогнутый слайд для средних и поздних семян. В зависимости от стадий развития семян, инкубируйте их при комнатной температуре для очистки. После инкубации наблюдают образцы с дифференциальным интерференционным контрастом или ОВС-микроскопом, оснащенным цифровой камерой с 10-кратным, 20-кратным и 40-кратным увеличением.Отрегулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захват изображений. Переложите свежие семена, собранные из разбитых плодов, в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую 1,5 миллилитра дезинфицирующего раствора. Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере при 30 оборотах в минуту в течение трех-50 минут при комнатной температуре.Как только будет хорошо виден самый внутренний контур оболочки семян, отбросьте дезинфицирующий раствор. Для средних и поздних семян перенесите семена на горку. Используйте щипцы и рассекающую иглу для удаления семенной слизи под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа.Перенесите семена обратно в исходную центрифужную трубку с помощью щипцов. Вымойте их пять раз в 1,5 миллилитрах деионизированной воды в течение 10 секунд каждый и выбросьте деионизированную воду. Далее добавьте к семенам двойной объем очищающего раствора.В зависимости от стадии семени, давайте прерывистую вакуумную обработку в течение от нуля до 50 минут, с интервалом в 10 минут после каждой вакуумной обработки 10 минут. После вакуумной обработки замените очищающий раствор. Чтобы облегчить очистку семян, поместите центрифужную трубку защищенной от света на 30 минут до семи дней при комнатной температуре.В случае поздних эмбрионов ежедневно заменяйте раствор свежим очищающим раствором, после чего подвергайте семена вакуумной обработке в течение 10 минут. Поместите очищенные семена на горку или один вогнутый слайд. Используя микроскоп DIC, оснащенный цифровой камерой, регулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захватывайте изображение.При традиционном методе очистки семян S.lycopersicum плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов при 3 и 6 DAF. Снижение проницаемости во время роста семян приводило к нечетким изображениям после 9 DAF. Слизь семян и оболочка семян постепенно становились плотнее, предотвращая проникновение очищающих агентов от 13 DAF и далее.Контур эмбриона внутри 14-19 семян DAF был чрезвычайно размытым, несмотря на увеличенное время обработки в семь дней. Внутренняя структура в 22 семенах DAF была совершенно невидимой. Зачищенная слизь семенной оболочки, полученная эпидермальными клетками семенной оболочки, была заметна начиная с 13 DAF и далее.Обработка гипохлорита натрия позволила четко идентифицировать внутреннюю оболочку семян и отслоить большую часть адгезивной слизи без повреждения семян. В оптимизированном протоколе очистки семена показали удовлетворительную прозрачность на всех проверенных стадиях развития. Наблюдались отчетливые клеточные слои семенной оболочки при 3 DAF, различимые клетки эндосперма при 5 DAF, палочковидный эмбрион при семи DAF, шаровидная стадия при 9 DAF и стадия сердца при 11 DAF.В оптимизированном протоколе степень скручивания семядолий и стреляющей апикальной меристемы очень легко фиксировалась на различных стадиях эмбрионального развития. Стерилизация удаляет слизь семян и пигмент семенной оболочки, которые улучшают проникновение семян и визуализацию. Вакуумная обработка может ускорить проникновение очищающего раствора.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em&gt; Экс-ово</em&gt; Электропорация подход

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-локализация клеточных клонов Маркеры и томата Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...