Name: an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

Yazarlar, sırasıyla diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve geleneksel temizleme yöntemi hakkındaki yararlı önerileri için Dr. Jie Le ve Dr. Xiufen Song'a minnettardır. Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31870299) ve Çin Bilimler Akademisi Gençlik İnovasyon Teşvik Derneği tarafından finanse edildi. Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Çözeltilerin hazırlanması
<ol><li>50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2,5 mL% 37 formaldehit, 2,5 mL buzul asetik asit ve 45 mL% 70 etanol ekleyerek FAA fiksatif hazırlayın. Vorteks yapın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce FAA fiksatif hazırlayın. DİKKAT: %37 formaldehit aşındırıcıdır ve maruz kalırsa veya solunduğunda potansiyel olarak kanserojendir. Fiksatif, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerken bir duman başlığında yapılmalıdır.</li>
	<li>Kalay folyo ile...

<ol>
	<li>. FAOSTAT Available from: <a target="_blank" href="https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL">https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL</a> (2022)</li><li>Olmstead, R. G., Bohs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+summary+of+molecular+systematic+research+in+Solanaceae:+1982-2006.">A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006.</a> Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).</li><li>Consortium, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+genome+sequence+provides+insights+into+fleshy+fruit+evolution.">The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution.</a> Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).</li><li>Ebert, A. W., Chou, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+collection+maintained+by+AVRDC+-+The+World+Vegetable+Center:+composition,+germplasm+dissemination+and+use+in+breeding.">The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding.</a> Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).</li><li>Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+seed+as+a+model+system+to+study+seed+development+and+germination.">The tomato seed as a model system to study seed development and germination.</a> Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).</li><li>Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+structural+details+of+tomato+seed+coat+formation:+A+different+functional+role+of+the+inner+and+outer+epidermises+in+unitegmic+ovule.">Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule.</a> Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).</li><li>Iwahori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+temperature+injuries+in+tomato.+V.+Fertilization+and+development+of+embryo+with+special+reference+to+the+abnormalities+caused+by+high+temperature.">High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature.</a> Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).</li><li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tomato+reproductive+developmental+landmarks+and+expression+profiles,+and+the+effect+of+SUN.+on+fruit+shape.">Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).</li><li>Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+mechanisms+involved+in+seed+priming.">Physiological mechanisms involved in seed priming.</a> Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).</li><li>Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+germination-emerging+mechanisms+and+new+hypotheses.">Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).</li><li>Doll, N. M., Ingram, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-endosperm+interactions.">Embryo-endosperm interactions.</a> Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).</li><li>Serrani, J. C., Fos, M., Atar&#233;s, A., Garc&#237;a-Mart&#237;nez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gibberellin+and+auxin+on+parthenocarpic+fruit+growth+induction+in+the+cv+micro-tom+of+tomato.">Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+gene+induces+trichome+formation+and+embryo+lethality+in+tomato.">A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).</li><li>Goetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cis-12-oxo-phytodienoic+acid+in+tomato+embryo+development.">Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).</li><li>Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporter+SlSWEET15+unloads+sucrose+from+phloem+and+seed+coat+for+fruit+and+seed+development+in+tomato.">Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato.</a> Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearSee:+A+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging.">ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), (2021).</li><li>Kwiatkowska, M., Kad&#322;uczka, D., W&#281;dzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+a+clearing+protocol+to+study+crassinucellate+ovules+of+the+sugar+beet+(Beta+vulgaris+L.,+Amaranthaceae).">Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae).</a> Plant Methods. 15, 71 (2019).</li><li>Ponitka, A., &#346;lusarkiewicz-Jarzina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleared-ovule+technique+used+for+rapid+access+to+early+embryo+development+in+Secale+cereale+&#215;+Zea+mays+crosses.">Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale &#215; Zea mays crosses.</a> Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).</li><li>Ceccato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+PIN1+is+required+for+female+gametophyte+development+in+Arabidopsis.">Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis.</a> PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).</li><li>Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+clearing+protocol+for+the+quantitative+assessment+of+sub-epidermal+ovule+tissues+within+whole+cereal+pistils.">An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils.</a> Plant Methods. 13, 67 (2017).</li><li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+clearing+and+staining+of+Arabidopsis+flower+organs+and+Siliques.">Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).</li><li>Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanically+sensitive+cell+layer+regulates+the+physical+properties+of+the+Arabidopsis+seed+coat.">A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat.</a> Nature Communications. 6, 6382 (2015).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B3+domain-containing+transcription+factor+ZmABI19+coordinates+expression+of+key+factors+required+for+maize+seed+development+and+grain+filling.">The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling.</a> Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).</li><li>Anderson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoyer's+solution+as+a+rapid+permanent+mounting+medium+for+bryophytes.">Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes.</a> Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).</li><li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+clearing-squash+technique+for+the+study+of+ovule+development+in+angiosperms.">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).</li><li>Yadegari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+and+morphogenesis+are+uncoupled+in+Arabidopsis+raspberry+embryos.">Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos.</a> The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).</li><li>Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+development+is+disrupted+in+the+female+gametophytic+capulet+mutants+of+Arabidopsis.">Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis.</a> Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).</li><li>Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+growth+and+pseudoembryo+development+affected+by+uniconazole,+an+inhibitor+of+gibberellin+biosynthesis,+in+pat-2+and+auxin-Induced+parthenocarpic+tomato+fruits.">Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits.</a> Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).</li><li>de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Solanum+lycopersicum+auxin+response+factor+7+(SlARF7)+regulates+auxin+signaling+during+tomato+fruit+set+and+development.">The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development.</a> Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).</li><li>Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+tomato+endosperm+transcriptomes+reveal+common+roles+of+genomic+imprinting+in+both+nuclear+and+cellular+endosperm.">Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm.</a> Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).</li><li>Orsi, C. H., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+an+ABC+transporter+gene+associated+with+seed+size+evolution+in+tomato+species.">Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species.</a> PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).</li><li>Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+seed+size+in+Arabidopsis+for+mutant+and+QTL+discovery.">Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery.</a> Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).</li><li>Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLE19+expressed+in+the+embryo+regulates+both+cotyledon+establishment+and+endosperm+development+in+Arabidopsis.">CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).</li><li>Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+mucilage+as+a+new+source+of+biodegradable+film-forming+material:+effect+of+glycerol+and+cellulose+nanofibers+on+the+characteristics+of+resultant+films.">Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films.</a> Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).</li><li>Gardner, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+botanical+clearing+technique.">An overview of botanical clearing technique.</a> Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).</li><li>Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+a+semipermeable+layer+in+seed+coats+of+leek+and+onion+(Liliaceae),+tomato+and+pepper+(Solanaceae).">Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae).</a> Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).</li><li>Stebbins, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bleaching+and+clearing+method+for+plant+tissues.">A bleaching and clearing method for plant tissues.</a> Science. 87 (2245), 21-22 (1938).</li><li>Debenham, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+the+microscopic+examination+of+the+xylem+of+whole+plants+or+plant+organs.">A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs.</a> Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).</li><li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen.">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li></ol>

Mekanik kesitleme ile karşılaştırıldığında, temizleme teknolojisi, bitki dokularının veya organlarının bütünlüğünü koruduğu için üç boyutlu görüntüleme için daha avantajlıdır16. Geleneksel temizleme protokolleri, kimyasal çözeltilerin daha kolay nüfuz etmesi nedeniyle genellikle küçük numunelerle sınırlıdır. Domates tohumu, doku temizliği için sorunlu bir örnektir, çünkü boyut olarak bir Arabidopsis tohumundan yaklaşık 70 kat daha büyüktür ...

Domates (S. lycopersicum L.), 2020 yılında 5,1 milyon hektardan 186,8 milyon ton etli meyve üretimi ile dünyadaki en önemli sebze mahsullerinden biridir1. Patlıcan, biber, patates ve tütün gibi ticari açıdan önemli birçok ürün de dahil olmak üzere yaklaşık 2.716 tür2 ile büyük Solanaceae familyasına aittir. Ekili domates, genom boyutu yaklaşık 900 Mb3 olan bir diploid türüdür (2n = 2x = 24). Uzun süredir, yabani Solanum spp'den arzu edilen özellikleri seçerek domates evcilleştirme ve ıslahına yönelik büyük çaba sarf edilmiştir. Domates Genetiği Kaynak Merkezi'nde listelenen 5.000'den fazla domates katılımı vardır ve dünya çapında 80.000'den fazla germplazma domates depolanmaktadır4. Domates bitkisi serada çok yıllıktır ve tohumlarla yayılır. Olgun bir domates tohumu üç ana bölmeden oluşur: tam yetişkin bir embriyo, artık hücresel tip endosperm ve sert bir tohum kabuğu 5,6 (Şekil 1A). Çift döllenmeden sonra, hücresel tip endosperm gelişimi, zigotların gelişiminden önce gelir. Çiçeklenmeden (DAF) ~ 5-6 gün sonra, endosperm altı ila sekiz çekirdek7'den oluştuğunda iki hücreli proembriyo ilk önce gözlenir. Solanum pimpinellifolium'da, embriyo 20 DAF'tan sonra son boyutuna yaklaşır ve tohumlar 32 DAF8'den sonra çimlenme için uygundur. Embriyo geliştikçe, endosperm yavaş yavaş emilir ve tohumda sadece az miktarda endosperm kalır. Kalıntı endosperm, radikül ucunu çevreleyen mikropylar endosperm ve tohumun geri kalanında lateral endosperm 9,10'dan oluşur. Dış tohum kabuğu, bütünlüğün kalınlaşmış ve odunlaşmış dış epidermisinden gelişir ve bütünleşme kalıntılarının ölü katmanlarıyla, embriyoyu ve endospermi korumak için sert bir kabuk oluştururlar5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> Resim 1: Solanum lycopersicum ve Arabidopsis thaliana'da olgun bir tohumun şematik gösterimi . (A) Olgun bir domates tohumunun uzunlamasına anatomisi. (B) Olgun bir Arabidopsis tohumunun uzunlamasına anatomisi. Olgun bir domates tohumu, bir Arabidopsis tohumundan yaklaşık 70 kat daha büyüktür. Ölçek çubukları = (A) 400 μm, (B) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Yüksek kaliteli domates tohumlarının üretimi, embriyo, endosperm ve maternal tohum bileşenleri arasındaki koordinasyona bağlıdır11. Tohum gelişimindeki anahtar genlerin ve ağların diseksiyonu, mutant tohumların derin ve tam hatlı bir fenotipik kaydını gerektirir. Yarı ince kesit ve parafin kesit gibi geleneksel gömme-kesit teknikleri, embriyonun yerel ve daha ince yapılarını gözlemlemek için domates tohumlarına yaygın olarak uygulanır12,13,14,15. Bununla birlikte, tohum gelişimini ince kesitlerden analiz etmek genellikle zahmetlidir ve z ekseni uzamsal çözünürlüğünden yoksundur. Buna karşılık, doku temizleme, ortaya çıkması en muhtemel embriyo defektlerinin gelişim aşamasını belirlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir16. Temizleme yöntemi, kırılma indisini bir veya daha fazla biyokimyasal ajanla homojenleştirerek iç dokunun opaklığını azaltır16. Tüm doku temizleme, bir bitki doku yapısının bütünlüğünü bozmadan gözlemlenmesine izin verir ve temizleme teknolojisi ile üç boyutlu görüntülemenin kombinasyonu, bir bitki organının morfolojisi ve gelişimsel durumu hakkında bilgi edinmek için ideal bir çözüm haline gelmiştir17,18. Yıllar geçtikçe, Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare ve Beta vulgaris19,20,21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli bitki türlerinde tohum temizleme teknikleri kullanılmıştır. Bunlar arasında, bütün monte edilmiş ovül temizleme teknolojisi, küçük boyutu, tohum kabuğu hücresinin 4-5 katmanı ve nükleer tip endosperm24,25 nedeniyle Arabidopsis'in tohum gelişimini incelemek için etkili bir yaklaşım olmuştur. Hoyer çözeltisi26'nın ortaya çıkması gibi farklı temizleme karışımlarının sürekli güncellenmesiyle, arpa ovülünün iç yapıları, endospermi tohumların büyük kısmını oluşturmasına rağmen, yüksek derecede netlikle görüntülenmiştir. Şeker pancarının embriyogenezi, vakum işlemi ile birlikte temizlenerek ve hidroklorik asit19 ile yumuşatılarak gözlemlenebilir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen türlerin aksine, domates tohumlarındaki protokollerin temizlenmesiyle embriyolojik gözlemler bildirilmemiştir. Bu, domateslerin embriyonik ve tohum gelişiminin ayrıntılı bir şekilde araştırılmasını önler.
Kloral hidrat, daldırılmış dokuların ve hücrelerin farklı optik düzlemlerde görüntülenmesini sağlayan ve hücreleri veya doku bileşenlerini büyük ölçüde koruyan bir temizleme çözeltisi olarak yaygın olarak kullanılır27,28,29. Kloral hidrat bazlı temizleme protokolü, Arabidopsis21,28'in embriyosunu ve endospermini gözlemlemek için tohumların tamamen temizlenmesi için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu temizleme çözeltisi, Arabidopsis tohumlarından daha geçirimsiz olan domates tohumlarının temizlenmesinde etkili değildir. Fiziksel engeller şunları içerir: (1) domates bütünlüğünün 3 ila 15 DAF 30,31'de yaklaşık 20 hücre katmanı vardır, (2) domates endospermi nükleer tip 32 değil, hücresel tiptedir ve (3) domates tohumları 33,34 boyutunda yaklaşık70 kat daha büyüktür ve (4) temizleme reaktiflerinin penetrasyonunu engelleyen ve embriyo hücrelerinin görselleştirilmesini etkileyen büyük miktarlarda tohum kabuğu müsilajı üretir.
Bu nedenle, bu rapor, domates tohumlarının farklı aşamalarda tamamen monte edilmesi için optimize edilmiş bir kloral hidrat bazlı temizleme yöntemi sunar ve bu da embriyo gelişim sürecinin derin görüntülenmesini sağlar (Şekil 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>DAMAO</td>
			<td>685-2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-5000-TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>678-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB800-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral Hydrate</td>
			<td>Meryer</td>
			<td>M13315-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Leica</td>
			<td>384200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager A1</td>
			<td>10x, 20x and 40x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant</td>
			<td>QIKELONGAN</td>
			<td>17-9185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flower nutrient soil</td>
			<td>FANGJIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>HAIOU</td>
			<td>4-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>BOYUAN</td>
			<td>676-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RET basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tom</td>
			<td>Tomato Genetics Resource Center</td>
			<td>LA3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seeding substrate</td>
			<td>PINDSTRUP</td>
			<td>LV713/018-LV252</td>
			<td>Screening:0-10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single concave slide</td>
			<td>HUABODEYI</td>
			<td>HBDY1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 APO</td>
			<td>1x to 4x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin foil</td>
			<td>ZAOWUFANG</td>
			<td>613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>SHIDING</td>
			<td>SHB-III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex meter</td>
			<td>Silogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient clearing protocol for the study of seed development in tomato (solanum lycopersicum l.)

Domates (Solanum lycopersicum L.) dünya çapında en büyük nakit mahsullerinden biridir. Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bir domates tohumu içindeki daha ince embriyonik yapının görselleştirilmesi genellikle tohum kabuğu müsilajı, çok hücreli katmanlı bütünlük ve zahmetli gömme bölümleme ile çözülmesi gereken kalın duvarlı bir endosperm tarafından engellenir. Daha basit bir alternatif, kimyasal maddeler kullanarak tohumu neredeyse şeffaf hale getiren doku temizleme teknikleri kullanmaktır. Geleneksel temizleme prosedürleri, daha ince bir tohum kabuğuna sahip daha küçük tohumlara derinlemesine bilgi vermesine rağmen, domates tohumlarının temizlenmesi, özellikle geç gelişim aşamalarında, teknik olarak zor olmaya devam etmektedir.
Burada, embriyonik morfolojinin neredeyse tamamlandığı çiçeklenmeden 3 ila 23 gün sonra domates tohumu gelişimini gözlemlemek için hızlı ve emek tasarrufu sağlayan bir temizleme protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, Arabidopsis'te yaygın olarak kullanılan kloral hidrat bazlı temizleme çözeltisini, Formalin-Aseto-Alkol (FAA) fiksasyonunun ihmal edilmesi, tohumların sodyum hipoklorit muamelesinin eklenmesi, yumuşatılmış tohum kabuğu müsilajının çıkarılması ve yıkama ve vakum işlemi dahil olmak üzere diğer modifikasyonlarla birleştirir. Bu yöntem, domates tohumlarının farklı gelişim aşamalarında verimli bir şekilde temizlenmesi için uygulanabilir ve mutant tohumların gelişim sürecinin iyi mekansal çözünürlükle tam olarak izlenmesinde yararlıdır. Bu temizleme protokolü, Solanaceae'deki ticari olarak önemli diğer türlerin derin görüntülenmesine de uygulanabilir.

Domates tohumları Arabidopsis'te olduğu gibi geleneksel bir yöntem kullanılarak temizlendiğinde, yoğun endosperm hücreleri erken domates embriyolarının 3 DAF ve 6 DAF'ta görselleştirilmesini engelledi (Şekil 3A, B). Embriyonun toplam hacmi arttıkça, küresel bir embriyo 9 DAF'ta zar zor ayırt edilebildi (Şekil 3C). Bununla birlikte, tohum büyüklüğü artmaya devam ettikçe, geçirgenliği azaldı ve 12 DAF'ta bulanık...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L. at JoVE.com

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bu protokol, daha ince embriyonik yapıyı gözlemlemek için farklı gelişim aşamalarında domates tohumlarının temizlenmesi için yararlıdır.

Domateste Tohum Geliştirme Çalışması için Verimli Bir Takas Protokolü (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Bu yöntem, araştırmaların domates embriyosu gelişiminin anormal dönemlerini hızlı ve zahmetsizce bulmalarına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, domates tohumlarının domates embriyolarının gözlemlenmesi için bir temel sağlayan sodyum hipoklorit ile muamele edilmesidir. Çiçeklenme veya DAF'tan üç ila 23 gün sonra Solanum lycopersicum meyvelerinin kimyasal olarak hazırlanması ve toplanmasıyla başlayın.Meyveleri hemen buz üzerine koyun ve çiçeklenmeden sonraki günlere göre erken, orta ve geç meyvelere bölün. Erken meyveyi kırın, bir slayta koyun ve stereo mikroskobun 1x ila 4x büyütmesi altında hassas forseps ile taze tohumları dikkatlice toplayın. Orta ve geç meyveler için, meyveyi kırın ve hassas forseps kullanarak doğrudan taze tohumlar toplayın.Geleneksel yöntemde, taze toplanan tohumları derhal 1,5 mililitre FAA fiksatif içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında dört saat boyunca 5 rpm'de orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra tohumları% 70% 95 ve% 100 etanol içinde, 5 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda her biri bir saat boyunca dehidre edin. Tamamlandığında, tohumu slaytta bulunan üç ila beş damla temizleme çözeltisine yerleştirin ve yavaşça bir kapak kayması ile örtün.Orta ve geç tohumlar için tek bir içbükey slayt kullanın. Tohumların gelişim aşamalarına bağlı olarak, temizleme için oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, numuneleri diferansiyel girişim kontrastı veya 10x, 20x ve 40x büyütmede bir dijital kamera ile donatılmış DIC mikroskobu ile gözlemleyin.İletilen ışık parlaklığını, DIC kaydırıcısını ve kondenser diyaframını her örnek için gerçek zamanlı olarak ayarlayın ve optimize edin ve görüntüleri yakalayın. Kırık meyvelerden toplanan taze tohumları, 1,5 mililitre dezenfektan çözeltisi içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri 30 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında üç ila 50 dakika boyunca inkübe edin.En içteki tohum kabuğu taslağı açıkça görülebildiğinde, dezenfektan çözeltisini atın. Orta ve geç tohumlar için, tohumları bir slayta aktarın. Stereo mikroskobun 1x ila 4x büyütmesi altındaki tohum müsilajını çıkarmak için forseps ve diseksiyon iğnesi kullanın.Forseps kullanarak tohumları orijinal santrifüj tüpüne geri aktarın. Her biri 10 saniye boyunca 1,5 mililitre deiyonize suda beş kez yıkayın ve deiyonize suyu atın. Ardından, temizleme çözeltisinin çift hacmini tohumlara ekleyin.Tohum aşamasına bağlı olarak, aralıklı vakum işlemini sıfır ila 50 dakika boyunca, 10 dakikalık her vakum işleminden sonra 10 dakikalık aralıklarla verin. Vakumlu işlemden sonra, temizleme çözeltisini değiştirin. Tohumların temizlenmesini kolaylaştırmak için, ışıktan korunan santrifüj tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika ila yedi gün boyunca yerleştirin.Geç embriyolar durumunda, çözeltiyi günlük olarak taze bir temizleme çözeltisi ile değiştirin, ardından tohumları 10 dakika boyunca vakum işlemine tabi tutun. Temizlenmiş tohumları slayta veya tek içbükey slayta yerleştirin. Dijital kamera ile donatılmış DIC mikroskobu kullanarak, iletilen ışık parlaklığını, DIC kaydırıcısını ve kondenser diyaframını her örnek için gerçek zamanlı olarak ayarlayın ve optimize edin ve görüntüyü yakalayın.Geleneksel S.lycopersicum tohumlarını temizleme yönteminde, yoğun endosperm hücreleri erken embriyoların 3 ve 6 DAF'ta görselleştirilmesini engelledi. Tohum büyümesi sırasında azalan geçirgenlik, 9 DAF'tan sonra bulanık görüntülere neden oldu. Tohum müsilaj ve tohum kabuğu giderek daha yoğun hale geldi ve 13 DAF'tan itibaren temizleme maddelerinin nüfuz etmesini engelledi.14 ila 19 DAF tohumunun içindeki embriyonun ana hatları, yedi günlük uzun tedavi süresine rağmen son derece bulanıktı. 22 DAF tohumundaki iç yapı tamamen görünmezdi. Tohum kabuğu epidermal hücreleri tarafından üretilen soyulmuş tohum kabuğu müsilajı, 13 DAF'tan itibaren belirgindi.Sodyum hipoklorit muamelesi, iç tohum kabuğunun net bir şekilde tanımlanmasını ve yapışkan müsilajın çoğunun tohum hasarı olmadan ayrılmasını sağladı. Optimize edilmiş temizleme protokolünde, tohumlar test edilen tüm gelişim aşamalarında tatmin edici şeffaflık göstermiştir. 3 DAF'ta tohum kabuğunun farklı hücre katmanları, 5 DAF'ta ayırt edilebilir endosperm hücreleri, yedi DAF'ta çubuk şeklindeki embriyo, 9 DAF'ta küresel aşama ve 11 DAF'ta kalp aşaması gözlendi.Optimize edilmiş protokolde, kotiledonların kıvrılma derecesi ve sürgün apikal meristemi, embriyonik gelişimin çeşitli aşamalarında çok kolay bir şekilde yakalandı. Sterilizasyon, tohum penetrasyonunu ve görselleştirmeyi artıran tohum müsilajını ve tohum kabuğu pigmentini giderir. Vakum işlemi, temizleme çözeltisinin penetrasyonunu hızlandırabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...