Name: a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par un prix Bridge to Independence de la Fondation Simons (SFARI Award #387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), une bourse de recherche de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) et des subventions de recherche de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de la Whitehall Foundation (J.J.Y.) et du NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

1. Clonage de mutagenèse pour générer des variantes d’Ube3a
<ol><li>Cloner toutes les variantes d’Ube3a dans le plasmide pCIG2 (Figure 1A), un vecteur bicistronique qui contient un promoteur de la β-actine de poulet et un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour l’expression EGFP19. Les constructions Ube3a complètes contiennent une séquence Myc-tag N-terminale et sont clonées en pCIG2 à l’aide d’u...

<ol>
	<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype.">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li><li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60,706+humans.">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+interpretation:+Functional+assays+to+the+rescue.">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li><li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53.">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li><li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene,+Ube3a,+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons.">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li><li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Angelman+syndrome+candidate+gene,+UBE3A/E6-AP,+is+imprinted+in+brain.">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li><li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene,+UBE3A,+is+restricted+to+brain.">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li><li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE3A/E6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome.">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li><li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation.">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li><li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome:+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes.">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li><li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13.">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li><li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism,+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature.">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics.">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li><li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECT+E3s+and+human+disease.">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, (2007).</li><li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein.">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li><li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development.">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt/beta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome.">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li><li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis.">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).</li><li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum.">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30 (2011).</li><li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells.">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li><li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+beta-catenin/TCF+transcription+with+beta-catenin/TCF+transcription-based+reporter+constructs.">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A.">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li><li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn(2+)-binding+N-terminal+(AZUL)+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome.">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li><li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+E6-AP+gene+(UBE3A)+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li><li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome.">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li><li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations.">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li></ol>

Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace et évolutive pour évaluer l’activité enzymatique des variantes d’Ube3a. Plusieurs détails techniques méritent d’être soigneusement examinés lors de l’utilisation de ce test. Une considération est le choix des plasmides rapporteurs Wnt utilisés dans ce test. Le protocole décrit ici utilise spécifiquement le rapporteur activé par la β-caténine (BAR)21, un rapporteur qui contient un concatémère de 12 éléments de...

Les progrès technologiques récents ont rendu le séquençage des exomes et des génomes systématique en milieu clinique 1,2. Cela a conduit à la découverte d’un grand nombre de variantes génétiques, y compris des millions de variantes faux-sens qui modifient généralement un acide aminé dans une protéine. Comprendre la signification fonctionnelle de ces variantes reste un défi, et seule une petite fraction (~2%) des variantes faux-sens connues ont une interprétation clinique 1,3.
Un exemple frappant de ce problème est Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 qui cible les protéines substrat pour la dégradation4. Ube3a réside dans le chromosome 15q11-13 et est exprimé exclusivement à partir de l’allèle maternel 5,6,7. Les observations de la génétique de la maladie suggèrent fortement qu’une activité insuffisante ou excessive de l’enzyme UBE3A provoque des troubles neurodéveloppementaux distincts. La délétion du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome d’Angelman (SA)8, un trouble caractérisé par une déficience intellectuelle sévère, des déficiences motrices, des convulsions, un comportement heureux avec des sourires fréquents et des traits du visage dysmorphiques 8,9,10. En revanche, la duplication ou la triplication du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome Dup15q, une maladie hétérogène reconnue comme l’une des formes syndromiques les plus répandues de l’autisme11,12,13. En outre, il existe des centaines de variantes faux-sens identifiées dans Ube3a, dont la majorité sont considérées comme des variantes de signification incertaine (VUS) car leur signification fonctionnelle et clinique est inconnue. Ainsi, il existe un intérêt considérable pour le développement de méthodes permettant d’évaluer empiriquement les variantes d’Ube3a afin de déterminer si elles contribuent à la maladie neurodéveloppementale.
L’enzyme UBE3A appartient à la famille de domaines HECT (homologue à E6-AP C-terminus) des ligases d’ubiquitine E3 qui possèdent toutes le domaine HECT éponyme, qui contient la machinerie biochimique nécessaire pour accepter l’ubiquitine activée des enzymes E2 et la transférer aux protéines substrat14. Historiquement, la caractérisation des enzymes E3 s’est appuyée sur des systèmes in vitro reconstitués qui nécessitent un ensemble de protéines purifiées 4,15,16. Ces méthodes sont lentes et laborieuses et ne se prêtent pas à l’évaluation de l’activité d’un grand nombre de variantes. Dans des travaux antérieurs, UBE3A a été identifié pour activer la voie Wnt dans les cellules HEK293T en modulant la fonction du protéasome pour ralentir la dégradation de la β-caténine17. Cet aperçu permet l’utilisation des rapporteurs de trajectoire Wnt comme méthode efficace et rapide pour identifier les variantes de perte et de gain de fonction d’Ube3a18. Le protocole ci-dessous décrit en détail une méthode pour générer des variantes Ube3a ainsi qu’un rapporteur basé sur la luciférase pour évaluer les changements dans l’activité des variants Ube3a.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Kb DNA ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M108-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium Salt</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>KCC46000-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber&#160; slides</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td>
			<td>Intact Genomics</td>
			<td>1011-12</td>
			<td>E. coli DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12643</td>
			<td>Midi prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCIG2 plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL3 BAR plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td>
			<td>Applied biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK Renilla plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Mini prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants

L’utilisation accrue du séquençage en médecine a permis d’identifier des millions de variantes codantes dans le génome humain. Beaucoup de ces variantes se produisent dans les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux, mais la signification fonctionnelle de la grande majorité des variantes reste inconnue. Le présent protocole décrit l’étude des variantes de Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 liée à la fois à l’autisme et au syndrome d’Angelman. La duplication ou la triplication d’Ube3a est fortement liée à l’autisme, alors que sa délétion provoque le syndrome d’Angelman. Ainsi, la compréhension de la valence des changements dans l’activité de la protéine UBE3A est importante pour les résultats cliniques. Ici, une méthode rapide basée sur les cellules qui associe les variantes Ube3a avec un rapporteur de voie Wnt est décrite. Ce test simple est évolutif et peut être utilisé pour déterminer la valence et l’ampleur des changements d’activité dans n’importe quelle variante d’Ube3a . De plus, la facilité de cette méthode permet la génération d’une mine d’informations structure-fonction, qui peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les mécanismes enzymatiques d’UBE3A.

Le criblage fonctionnel à grande échelle des variantes faux-sens d’Ube3a identifie un large paysage de mutations de perte et de gain de fonction Des travaux antérieurs avec des mutants Ube3a ont suggéré que la réponse Wnt peut servir de rapporteur de l’activité cellulaire de la protéine UBE3A. Ces observations ont été élargies et des expériences de validation supplémentaires ont été réalisées pour déterminer si le test BAR est approprié pour signaler une gamme ...

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A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.

Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

Notre méthode fournit un moyen rapide de comprendre l’impact fonctionnel des variantes d’Ube3a, une ubiquitine ligase qui cause le syndrome d’Angelman et est fortement liée à une forme génétique de l’autisme connue sous le nom de syndrome Dup15q. La caractérisation de l’activité de l’ubiquitine ligase est traditionnellement laborieuse et lente, et de telles méthodes sont difficiles et ne se prêtent pas vraiment à caractériser les centaines de variantes identifiées pour Ube3a. Le syndrome d’Angelman est causé par la délétion du gène maternel Ube3a, tandis que le syndrome Dup15q est causé par la duplication de l’Ube3a maternel, il est donc important de déduire comment les variantes faux-sens ont changé l’activité de l’enzyme Ube3a, et c’est quelque chose qui est difficile à faire sans tester empiriquement chaque variante.La démonstration de la procédure sera assurée par Jalin Stelzer, technicien de recherche dans mon laboratoire. Commencez par effectuer les tests sur des cellules HEK293T, cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone dans un récipient humidifié, comme décrit dans le manuscrit. Dans une enceinte de biosécurité, plaquer les cellules HEK293T en suspension sur une plaque à fond plat 96 puits traitée par culture tissulaire et incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés.Le deuxième jour, transfectez les cellules dans une armoire de biosécurité avec des plasmides rapporteurs Firefly et Renilla luciférase, et des plasmides Ube3a en trois exemplaires. Effectuer les transfections dans un volume total de 10 microlitres par puits. Créer un mélange maître pour les transfections pour chaque variante dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Après l’incubation, agiter doucement le mélange de transfection en tapotant le tube, puis ajouter 10 microlitres du mélange de transfection directement dans le milieu de croissance existant dans les puits. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur et laissez les plasmides s’exprimer pendant 48 heures. À l’aide d’un microscope à fluorescence, surveiller l’efficacité de la transfection par fluorescence GFP.Plus de 80% des cellules devraient exprimer la GFP après 48 heures. Aspirez soigneusement les milieux de culture des cellules HEK293T transfectées, puis lavez les cellules avec du PBS froid. Aspirez le PBS.Ajouter 25 microlitres de tampon de lyse non dénaturant pour la lyse cellulaire et incuber pendant 15 minutes sur la glace en balançant doucement. Ensuite, ajoutez 20 microlitres du lysat résultant dans une nouvelle plaque de dosage de 96 puits contenant 100 microlitres d’un réactif de substrat de luciférase Firefly et mélangez doucement la plaque en tapotant. Chargez la plaque jusqu’à un lecteur de plaques et mesurez la luminescence à l’aide d’un détecteur supérieur avec une hauteur de lecture d’un millimètre et un temps d’intégration d’une seconde.Immédiatement après avoir lu la luminescence luciférase Firefly, ajoutez 100 microlitres de substrat de Renilla luciferase aux puits, ce qui éteint l’activité de la luciférase Firefly tout en évaluant l’activité de Renilla luciferase. Mélanger les échantillons par agitation douce sur plaque et mesurer à nouveau la luminescence pour évaluer l’activité de Renilla luciferase. Comparez l’activité relative des protéines variantes en quantifiant les réponses du rapporteur et en normalisant la valeur de Firefly et Renilla pour chaque variante par rapport au type sauvage Ube3a.Les cellules HEK293T transfectées avec des quantités croissantes de plasmides codant pour Ube3a de type sauvage montrent une augmentation linéaire de la réponse BAR. Le test BAR identifie les variantes des plasmides liées à la maladie, démontrant la précision et la généralité de cette méthode. Le criblage BAR pour 152 variantes d’Ube3a montre une perte bénigne de fonction et un gain de mutations fonctionnelles par rapport à Ube3a de type sauvage.Le gain de substitution de la fonction glutamate, la perte de la substitution de la proline et une autre perte de fonction de substitution de l’arginine à la position 588 d’Ube3a ont produit des effets radicalement différents, soulignant ainsi l’importance de l’évaluation empirique des variantes. Le diagramme thermique montre les résultats BAR normalisés pour une analyse mutationnelle complète à la position 588 dans Ube3a. L’ombrage blanc représente les niveaux d’activité Ube3a de type sauvage, l’ombrage bleu indique la perte de fonction et l’ombrage rouge indique le gain de mutations fonctionnelles.Au-delà des implications cliniques de nos travaux, Ube3a fait partie de la famille des ubiquitines ligases du domaine HECT, qui possèdent toutes le domaine catalytique HECT conservé. Et je pense que l’un des aspects fascinants de notre travail est qu’il fournit de riches données sur la fonction de structure sur Ube3a, et cela peut être utilisé pour acquérir une compréhension mécaniste plus profonde pour cette classe d’enzymes.

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