Name: a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00
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इस काम को सिमन्स फाउंडेशन ब्रिज टू इंडिपेंडेंस अवार्ड (एसएफएआरआई पुरस्कार # 387972 द्वारा समर्थित किया गया था; जे.जे.वाई., मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (जे.जे.वाई.) से एनएआरएसएडी युवा अन्वेषक पुरस्कार, अल्फ्रेड पी स्लोन फाउंडेशन (जे.जे.वाई.) से एक शोध फैलोशिप, और एंजेलमैन सिंड्रोम फाउंडेशन (जे.जे.वाई.), व्हाइटहॉल फाउंडेशन (जे.जे.वाई.), और एनआईएमएच (आर01एमएच 122786) से अनुसंधान अनुदान; जे.जे.वाई.)।

1. यूबीई 3 ए वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए म्यूटेनेसिस क्लोनिंग
<ol><li>सभी यूबी 3 ए वेरिएंट को पीसीआईजी 2 प्लास्मिड (चित्रा 1 ए) में क्लोन करें, एक बिसिस्ट्रोनिक वेक्टर जिसमें ईजीएफपी अभ...

<ol>
	<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype.">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li><li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60,706+humans.">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+interpretation:+Functional+assays+to+the+rescue.">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li><li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53.">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li><li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene,+Ube3a,+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons.">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li><li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Angelman+syndrome+candidate+gene,+UBE3A/E6-AP,+is+imprinted+in+brain.">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li><li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene,+UBE3A,+is+restricted+to+brain.">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li><li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE3A/E6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome.">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li><li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation.">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li><li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome:+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes.">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li><li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13.">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li><li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism,+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature.">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics.">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li><li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECT+E3s+and+human+disease.">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, (2007).</li><li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein.">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li><li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development.">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt/beta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome.">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li><li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis.">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).</li><li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum.">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30 (2011).</li><li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells.">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li><li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+beta-catenin/TCF+transcription+with+beta-catenin/TCF+transcription-based+reporter+constructs.">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A.">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li><li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn(2+)-binding+N-terminal+(AZUL)+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome.">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li><li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+E6-AP+gene+(UBE3A)+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li><li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome.">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li><li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations.">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li></ol>

यहां वर्णित प्रोटोकॉल यूबीई 3 ए वेरिएंट की एंजाइमेटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए एक कुशल और स्केलेबल विधि प्रदान करता है। कई तकनीकी विवरण हैं जो इस परख का उपयोग करते समय सावधानीपूर्वक विचार करने क?...

हाल की तकनीकी प्रगति ने नैदानिक सेटिंग्स 1,2 में एक्सोम और जीनोम के अनुक्रमण को नियमित बना दिया है। इससे बड़ी संख्या में आनुवंशिक वेरिएंट की खोज हुई है, जिसमें लाखों गलत तरीके से वेरिएंट शामिल हैं जो आम तौर पर एक प्रोटीन में एक एमिनो एसिड को बदलते हैं। इन वेरिएंट के कार्यात्मक महत्व को समझना एक चुनौती बनी हुई है, और ज्ञात मिससेंस वेरिएंट के केवल एक छोटे से अंश (~ 2%) में नैदानिक व्याख्या 1,3 है।
इस समस्या का एक प्रमुख उदाहरण Ube3a है, एक जीन जो एक E3 यूबिकिटिन लिगेज को एन्कोड करता है जो गिरावट के लिए सब्सट्रेट प्रोटीनको लक्षित करता है। Ube3a क्रोमोसोम 15q11-13 के भीतर रहता है और विशेष रूप से मातृ विरासत वाले एलील 5,6,7 से व्यक्त किया जाता है। रोग आनुवंशिकी के अवलोकन दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि यूबीई 3 ए एंजाइम की अपर्याप्त या अत्यधिक गतिविधि अलग-अलग न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों का कारण बनती है। मातृ क्रोमोसोम 15q11-13 का विलोपन एंजेलमैन सिंड्रोम (एएस) 8 का कारण बनता है, एक विकार जो गंभीर बौद्धिक विकलांगता, मोटर हानि, दौरे, लगातार मुस्कुराने के साथ एक खुश व्यवहार और डिस्मॉर्फिक चेहरे की विशेषताओं 8,9,10 की विशेषता है। इसके विपरीत, मातृ गुणसूत्र 15q11-13 का दोहराव या ट्रिप्लिकेशन Dup15q सिंड्रोम का कारण बनता है, एक विषम स्थिति जिसे ऑटिज़्म 11,12,13 के सबसे प्रचलित सिंड्रोमिक रूपों में से एक के रूप में मान्यता प्राप्त है। इसके अलावा, Ube3a में पहचाने गए सैकड़ों गलत समझ वाले वेरिएंट हैं, जिनमें से अधिकांश को अनिश्चित महत्व (वीयूएस) के वेरिएंट माना जाता है क्योंकि उनके कार्यात्मक और नैदानिक महत्व अज्ञात हैं। इस प्रकार, उन तरीकों को विकसित करने में काफी रुचि है जो अनुभवजन्य रूप से यूबीई 3 ए वेरिएंट का आकलन कर सकते हैं ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वे न्यूरोडेवलपमेंटल बीमारी में योगदान करते हैं या नहीं।
यूबीई 3 ए एंजाइम ई 3 यूबिकिटिन लिगेस के एचईसीटी (ई 6-एपी सी-टर्मिनस के समरूप) डोमेन परिवार से संबंधित है, जिसमें सभी के पास नामांकित एचईसीटी डोमेन होता है, जिसमें ई 2 एंजाइमों से सक्रिय यूबिकिटिन को स्वीकार करने और इसे सब्सट्रेट प्रोटीन14 में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक जैव रासायनिक मशीनरी होती है। ऐतिहासिक रूप से, ई 3 एंजाइमों के लक्षण वर्णन ने पुनर्गठित इन विट्रो सिस्टम पर भरोसा किया है जिनके लिए शुद्ध प्रोटीन 4,15,16 की एक टुकड़ी की आवश्यकता होती है। इस तरह के तरीके धीमे और श्रम-गहन हैं और बड़ी संख्या में वेरिएंट की गतिविधि का आकलन करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। पिछले काम में, यूबीई 3 ए को एचईके 293 टी कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी मार्ग को सक्रिय करने के लिए β-कैटेनिन17 के क्षरण को धीमा करने के लिए प्रोटियासोम के कार्य को संशोधित करके पहचाना गया था। यह अंतर्दृष्टि डब्ल्यूएनटी पाथवे रिपोर्टर्स के उपयोग को एक कुशल और तेज़ विधि के रूप में Ube3a18 के हानि- और लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन वेरिएंट दोनों की पहचान करने की अनुमति देती है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल यूबी 3 ए वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए एक विधि के साथ-साथ यूबीई 3 ए वेरिएंट की गतिविधि में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक ल्यूसिफेरस-आधारित रिपोर्टर का विस्तार से वर्णन करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Kb DNA ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M108-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium Salt</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>KCC46000-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber&#160; slides</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td>
			<td>Intact Genomics</td>
			<td>1011-12</td>
			<td>E. coli DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12643</td>
			<td>Midi prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCIG2 plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL3 BAR plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td>
			<td>Applied biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK Renilla plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Mini prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants

चिकित्सा में अनुक्रमण के बढ़ते उपयोग ने मानव जीनोम में लाखों कोडिंग वेरिएंट की पहचान की है। इनमें से कई वेरिएंट न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों से जुड़े जीन में होते हैं, लेकिन वेरिएंट के विशाल बहुमत का कार्यात्मक महत्व अज्ञात रहता है। वर्तमान प्रोटोकॉल यूबी 3 ए के लिए वेरिएंट के अध्ययन का वर्णन करता है, एक जीन जो ऑटिज़्म और एंजेलमैन सिंड्रोम दोनों से जुड़े ई 3 यूबिकिटिन लिगेज को एन्कोड करता है। Ube3a का दोहराव या ट्राइप्लिकेशन ऑटिज़्म से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, जबकि इसका विलोपन एंजेलमैन सिंड्रोम का कारण बनता है। इस प्रकार, नैदानिक परिणामों के लिए यूबीई 3 ए प्रोटीन गतिविधि में परिवर्तन की वैधता को समझना महत्वपूर्ण है। यहां, एक तेजी से, सेल-आधारित विधि जो डब्ल्यूएनटी पाथवे रिपोर्टर के साथ यूबीई 3 ए वेरिएंट को जोड़ती है, का वर्णन किया गया है। यह सरल परख स्केलेबल है और इसका उपयोग किसी भी यूबीई 3 ए संस्करण में गतिविधि परिवर्तनों की वैलेंस और परिमाण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की सुविधा संरचना-फ़ंक्शन जानकारी के धन की पीढ़ी की अनुमति देती है, जिसका उपयोग यूबीई 3 ए के एंजाइमेटिक तंत्र में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

Ube3a मिससेंस वेरिएंट की बड़े पैमाने पर कार्यात्मक स्क्रीनिंग हानि- और लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन म्यूटेशन के व्यापक परिदृश्य की पहचान करती है Ube3a उत्परिवर्ती के साथ पिछले काम ने सुझाव दिया कि WNT प्रतिक्...

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A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

यूबी 3 ए में मिससेंस वेरिएंट के कार्यात्मक महत्व का आकलन करने के लिए एक सरल और स्केलेबल विधि विकसित की गई थी, एक जीन जिसका नुकसान और कार्य का लाभ एंजेलमैन सिंड्रोम और ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकार दोनों से जुड़ा हुआ है।

Ube3a वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक स्केलेबल, सेल-आधारित विधि

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

हमारी विधि यूबे 3 ए में वेरिएंट के कार्यात्मक प्रभाव को समझने का एक तेज़ तरीका प्रदान करती है, एक यूबिकिटिन लिगेज जो एंजेलमैन सिंड्रोम का कारण बनता है और ऑटिज़्म के आनुवंशिक रूप से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है जिसे डुप 15 क्यू सिंड्रोम के रूप में जाना जाता है। यूबिकिटिन लिगेज गतिविधि का लक्षण वर्णन पारंपरिक रूप से श्रम गहन और धीमा है, और इस तरह के तरीके मुश्किल हैं और वास्तव में यूबे 3 ए के लिए पहचाने गए सैकड़ों वेरिएंट को चिह्नित करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। एंजेलमैन सिंड्रोम मातृ यूबी 3 ए जीन के विलोपन के कारण होता है, जबकि डुप 15 क्यू सिंड्रोम मातृ यूबे 3 ए के दोहराव के कारण होता है, इसलिए यह पता लगाना महत्वपूर्ण है कि गलत वेरिएंट ने यूबी 3 ए एंजाइम की गतिविधि को कैसे बदल दिया, और यह कुछ ऐसा है जो प्रत्येक संस्करण का अनुभवपूर्वक परीक्षण किए बिना करना मुश्किल है।प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला में एक शोध तकनीशियन जालिन स्टेलज़र होगा। पांडुलिपि में वर्णित एक ह्यूमिडिफायर कंटेनर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस पर डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम में उगाए गए एचईके 293 टी कोशिकाओं में परख करके शुरू करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, निलंबित एचईके 293 टी कोशिकाओं को एक ऊतक-संस्कृति-उपचारित 96 अच्छी तरह से सपाट-तल वाली प्लेट पर चढ़ाएं और कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री पर इनक्यूबेट करें।दूसरे दिन, कोशिकाओं को जुगनू और रेनिला लूसिफेरस रिपोर्टर प्लास्मिड और यूबे 3 ए प्लास्मिड के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में तीन प्रतियों में स्थानांतरित करें। अभिकर्मकों को प्रति कुएं 10 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में निष्पादित करें। 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक संस्करण के लिए अभिकर्मकों के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाएं, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब को टैप करके अभिकर्मक मिश्रण को धीरे से उत्तेजित करें, और फिर, कुओं में मौजूदा विकास मीडिया में सीधे अभिकर्मक मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। बाद में, कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें और प्लास्मिड को 48 घंटे तक व्यक्त करने की अनुमति दें। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, जीएफपी प्रतिदीप्ति द्वारा अभिकर्मक दक्षता की निगरानी करें।80% से अधिक कोशिकाओं को 48 घंटों के बाद जीएफपी व्यक्त करना चाहिए। ट्रांसक्रिप्टेड एचईके 293 टी कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और फिर, ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को उत्तेजित करें।सेल लाइसिस के लिए गैर-विकृत लाइसिस बफर के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कोमल रॉकिंग के साथ बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, परिणामी लाइसेट के 20 माइक्रोलीटर को एक नई 96-अच्छी परख प्लेट में जोड़ें जिसमें जुगनू ल्यूसिफेरस सब्सट्रेट अभिकर्मक के 100 माइक्रोलीटर होते हैं, और टैप करके प्लेट को धीरे से मिलाएं। प्लेट को प्लेट रीडर पर लोड करें और एक मिलीमीटर की पढ़ने की ऊंचाई और एक सेकंड के एकीकरण समय के साथ एक शीर्ष डिटेक्टर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस को मापें।जुगनू लूसिफेरस ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने के तुरंत बाद, कुओं में रेनिला ल्यूसिफेरस सब्सट्रेट के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो रेनिला ल्यूसिफेरस गतिविधि का आकलन करते समय जुगनू लूसिफेरस गतिविधि को बुझाता है। कोमल प्लेट आंदोलन द्वारा नमूनों को मिलाएं और रेनिला लूसिफेरस गतिविधि का आकलन करने के लिए फिर से ल्यूमिनेसेंस को मापें। रिपोर्टर प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करके और जंगली प्रकार Ube3a के खिलाफ प्रत्येक संस्करण के लिए जुगनू और रेनिला मूल्य को सामान्य करके वेरिएंट प्रोटीन की सापेक्ष गतिविधि की तुलना करें।एचईके 293 टी कोशिकाएं प्लास्मिड एन्कोडिंग वाइल्ड-टाइप यूबी 3 ए की बढ़ती मात्रा के साथ स्थानांतरित होती हैं, जो बीएआर प्रतिक्रिया में रैखिक वृद्धि दिखाती हैं। बीएआर परख प्लास्मिड के रोग से जुड़े वेरिएंट की पहचान करता है, इस विधि की सटीकता और व्यापकता का प्रदर्शन करता है। 152 Ube3a वेरिएंट के लिए BAR परख स्क्रीन वाइल्ड-टाइप Ube3a के सापेक्ष फ़ंक्शन के सौम्य नुकसान और फ़ंक्शन म्यूटेशन के लाभ को प्रदर्शित करती है।फ़ंक्शन ग्लूटामेट प्रतिस्थापन का लाभ, फ़ंक्शन प्रोलाइन प्रतिस्थापन की हानि, और Ube3a के स्थान 588 पर फ़ंक्शन आर्गिनिन प्रतिस्थापन के एक और नुकसान ने काफी अलग प्रभाव पैदा किए, जिससे अनुभवजन्य संस्करण मूल्यांकन के महत्व को रेखांकित किया गया। हीट प्लॉट Ube3a में स्थिति 588 पर व्यापक उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए सामान्यीकृत BAR परिणाम दिखाता है। सफेद छायांकन जंगली प्रकार के यूबी 3 ए गतिविधि स्तरों का प्रतिनिधित्व करता है, नीला छायांकन फ़ंक्शन के नुकसान को इंगित करता है, और लाल छायांकन फ़ंक्शन म्यूटेशन के लाभ को इंगित करता है।हमारे काम के नैदानिक निहितार्थों से परे, Ube3a यूबिकिटिन लिगासेस के HECT डोमेन परिवार का एक सदस्य है, जो सभी के पास संरक्षित HECT उत्प्रेरक डोमेन है। और मुझे लगता है कि हमारे काम के आकर्षक पहलुओं में से एक यह है कि यह Ube3a के बारे में समृद्ध संरचना फ़ंक्शन डेटा प्रदान करता है, और इसका उपयोग एंजाइमों के इस वर्ग के लिए गहरी यांत्रिक समझ हासिल करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

वायरल बरकरार 3-D ब्रेन सर्किट के लक्ष्य निर्धारण के लिए स्केलेबल fluidic इंजेक्टर Arrays

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

एक साथ एमईजी और ईईजी के साथ कार्यात्मक मानचित्रण

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

सेरेब्रल Lateralization कार्यात्मक transcranial डॉपलर अल्ट्रासाउंड का उपयोग बच्चे में आकलन (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

उच्च संकल्प कार्यात्मक मानव मध्यमस्तिष्क के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग तरीके

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन्स द्वारा डायाफ्राम INNERVATION के कार्यात्मक और morphological आकलन

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

गोल्गी-कॉक्स विधि का उपयोग करते हुए वृद्ध चूहों में हिप्पोकैम्पल वृक्ष वृत्तीय जटिलता का आकलन

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

न्यूरोनल सर्किट पुनर्जीवित: फास्ट न्यूरैट एक्सटेंशन और फंक्शनल न्यूरॉनल कनेक्शन के लिए एक नई विधि

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

अवजालतनिका नकसीर के एक Murine मॉडल में सेरेब्रल Vasospasm के ठहराव के लिए एक Volumetric विधि

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Rodents में लौकिक प्रसंस्करण के मूल्यांकन के लिए Interstimulus अंतराल की शक्ति

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

μTongue: वीवो में जीभ के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक्स आधारित कार्यात्मक इमेजिंग प्लेटफॉर्म

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...