Name: a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00
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この作品は、サイモンズ財団の独立への橋渡し賞(SFARI賞#387972;J.J.Y.)、脳と行動研究財団(JJY)からのNARSAD若手研究者賞、アルフレッドP.スローン財団(JJY)からの研究フェローシップ、およびアンジェルマン症候群財団(J.J.Y)、ホワイトホール財団(J.J.Y.)、およびNIMH(R01MH122786;J.J.Y.)。

1. Ube3a 変異株を作製するための変異クローニング
<ol><li>すべての Ube3a 変異体を、ニワトリβアクチンプロモーターとEGFP発現のための内部リボソームエントリーサイト(IRES)を含むバイシストロニックベクターであるpCIG2プラスミド(図1A)にクローニングします19。完全長 Ube3a コンストラクトは、N末端Mycタグ配列を含み、5...

<ol>
	<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype.">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li><li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60,706+humans.">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+interpretation:+Functional+assays+to+the+rescue.">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li><li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53.">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li><li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene,+Ube3a,+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons.">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li><li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Angelman+syndrome+candidate+gene,+UBE3A/E6-AP,+is+imprinted+in+brain.">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li><li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene,+UBE3A,+is+restricted+to+brain.">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li><li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE3A/E6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome.">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li><li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation.">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li><li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome:+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes.">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li><li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13.">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li><li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism,+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature.">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics.">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li><li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECT+E3s+and+human+disease.">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, (2007).</li><li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein.">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li><li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development.">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt/beta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome.">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li><li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis.">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).</li><li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum.">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30 (2011).</li><li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells.">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li><li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+beta-catenin/TCF+transcription+with+beta-catenin/TCF+transcription-based+reporter+constructs.">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A.">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li><li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn(2+)-binding+N-terminal+(AZUL)+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome.">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li><li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+E6-AP+gene+(UBE3A)+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li><li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome.">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li><li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations.">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、Ube3a変異体の酵素活性を評価するための効率的でスケーラブルな方法を提供します。このアッセイを使用する際には、慎重な検討を必要とするいくつかの技術的な詳細があります。1つの考慮事項は、このアッセイで使用されるWntレポータープラスミドの選択です。ここで説明するプロトコルは、組換えとTCF結合部位の喪失を最小限に抑えるために特別に?...

最近の技術の進歩により、臨床現場ではエクソームとゲノムの配列決定が日常的になっています1,2。これにより、タンパク質中の1つのアミノ酸を通常変化させる数百万のミスセンス変異を含む、多数の遺伝的変異が発見されました。これらの変異体の機能的意義を理解することは依然として課題であり、既知のミスセンス変異体のごく一部(~2%)のみが臨床的解釈を持っています1,3。
この問題の顕著な例は、分解のために基質タンパク質を標的とするE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるUbe3aです4。Ube3aは染色体15q11-13内に存在し、母性遺伝対立遺伝子5,6,7からのみ発現します。疾患遺伝学からの観察は、UBE3A酵素の不十分または過剰な活性が明確な神経発達障害を引き起こすことを強く示唆しています。母体の染色体15q11-13の欠失は、重度の知的障害、運動障害、発作、頻繁な笑顔を伴う幸せな態度、および異形性顔の特徴を特徴とする障害であるアンジェルマン症候群(AS)8を引き起こします8,9,10。対照的に、母体の染色体15q11-13の重複または三重化は、自閉症の最も一般的な症候群形態の1つとして認識されている不均一な状態であるDup15q症候群を引き起こします11,12,13。さらに、Ube3aでは何百ものミスセンスバリアントが特定されており、その大部分は機能的および臨床的意義が不明であるため、重要性が不確実なバリアント(VUS)と見なされます。したがって、Ube3a変異体を経験的に評価して、それらが神経発達疾患に寄与するかどうかを判断する方法の開発には大きな関心が寄せられています。
UBE3A酵素は、E3ユビキチンリガーゼのHECT(E6-AP C末端に相同)ドメインファミリーに属し、すべてがE2酵素から活性化されたユビキチンを受け入れて基質タンパク質に転移するために必要な生化学的機構を含む同名のHECTドメインを有する14。歴史的に、E3酵素の特性評価は、精製タンパク質のアンサンブルを必要とする再構成されたin vitroシステムに依存してきました4,15,16。そのような方法は遅くそして労働集約的でありそして多数の変種の活性を評価するのには適していない。以前の研究では、UBE3Aは、プロテアソームの機能を調節してβ-カテニン17の分解を遅らせることにより、HEK293T細胞のWnt経路を活性化することが特定されました。この洞察により、Ube3a18の機能喪失変異体と機能獲得変異体の両方を特定するための効率的かつ迅速な方法としてWnt経路レポーターを使用できます。以下のプロトコルは、Ube3a変異体を生成する方法、ならびにUbe3a変異体の活性の変化を評価するためのルシフェラーゼベースのレポーターについて詳細に説明している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Kb DNA ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M108-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium Salt</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>KCC46000-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber&#160; slides</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td>
			<td>Intact Genomics</td>
			<td>1011-12</td>
			<td>E. coli DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12643</td>
			<td>Midi prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCIG2 plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL3 BAR plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td>
			<td>Applied biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK Renilla plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Mini prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants

医学におけるシーケンシングの使用の増加により、ヒトゲノムに何百万ものコーディングバリアントが特定されました。これらの変異体の多くは神経発達障害に関連する遺伝子に存在しますが、大多数の変異体の機能的重要性は不明のままです。本プロトコルは、自閉症およびアンジェルマン症候群の両方に関連するE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子である Ube3aの変異体の研究を記載している。 Ube3a の重複または三重化は自閉症と強く関連していますが、その欠失はアンジェルマン症候群を引き起こします。したがって、UBE3Aタンパク質活性の変化の価数を理解することは、臨床転帰にとって重要です。ここでは、 Ube3a 変異体とWnt経路レポーターをペアにする迅速な細胞ベースの方法について説明する。この単純なアッセイはスケーラブルであり、任意の Ube3a 変異体の活性変化の価数と大きさを決定するために使用できます。さらに、本手法の設備により、豊富な構造機能情報の生成が可能となり、UBE3Aの酵素機構を深く理解することができます。

Ube3aミスセンス変異体の大規模な機能スクリーニングにより、機能喪失および機能獲得変異の幅広い状況を特定 Ube3a変異体を用いた以前の研究は、Wnt応答が細胞UBE3Aタンパク質活性のレポーターとして役立つことを示唆した。これらの観察結果を拡張して、BARアッセイが細胞内のUBE3A活性の範囲を報告するのに適しているかどうかを調査するために、追加の検証実?...

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A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している 遺伝子であるUbe3aのミスセンスバリアントの機能的重要性を評価するために、簡単でスケーラブルな方法が開発されました。

Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

私たちの方法は、アンジェルマン症候群を引き起こし、Dup15q症候群として知られる自閉症の遺伝的形態と強く関連しているユビキチンリガーゼであるUbe3aの変異体の機能的影響を理解するための迅速な方法を提供します。ユビキチンリガーゼ活性の特性評価は伝統的に労働集約的で遅く、そのような方法は困難であり、Ube3aについて同定された何百もの変異体を特徴付けるのに実際には適していません。アンジェルマン症候群は母体のUbe3a遺伝子の欠失によって引き起こされますが、Dup15q症候群は母体のUbe3aの複製によって引き起こされるため、ミスセンスバリアントがUbe3a酵素の活性をどのように変化させたかを推測することが重要であり、これは各バリアントを経験的にテストせずに行うことは困難です。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるジャリン・ステルツァーです。原稿に記載されているように、ダルベッコの改変イーグル培地で摂氏37度で増殖したHEK293T細胞で、加湿容器に5%の二酸化炭素を入れてアッセイを実行することから始めます。バイオセーフティキャビネットで、吊り下げたHEK293T細胞を組織培養処理した96ウェル平底プレートにプレートし、細胞を37度で一晩インキュベートします。2日目に、バイオセーフティキャビネット内の細胞にホタルとシノイの木のルシフェラーゼレポータープラスミド、およびUbe3aプラスミドをトリプリケートでトランスフェクトします。トランスフェクションは、ウェルあたり総容量10マイクロリットルで行います。各バリアントのトランスフェクションのマスターミックスを1.5ミリリットルの微量遠心チューブで作成し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを軽くたたいてトランスフェクション混合物を穏やかに撹拌し、10マイクロリットルのトランスフェクション混合物をウェル内の既存の増殖培地に直接加えます。その後、細胞をインキュベーターに戻し、プラスミドを48時間発現させます。蛍光顕微鏡を用いて、GFP蛍光によるトランスフェクション効率をモニターする。細胞の80%以上が48時間後にGFPを発現するはずです。トランスフェクトされたHEK293T細胞から培養液を注意深く吸引し、次に細胞を冷たいPBSで洗浄します。PBSを吸引します。細胞溶解用に25マイクロリットルの非変性溶解バッファーを加え、穏やかに揺らしながら氷上で15分間インキュベートします。次に、得られたライセート20マイクロリットルを、100マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質試薬を含む新しい96ウェルアッセイプレートに加え、タップしてプレートを穏やかに混合します。プレートをプレートリーダーにロードし、読み取り高さ1ミリメートル、積分時間1秒のトップ検出器を使用して発光を測定します。ホタルルシフェラーゼ発光を読んだ直後に、100マイクロリットルのレニヤルシフェラーゼ基質をウェルに加え、ホタルルシフェラーゼ活性を消光させ、シタケルシフェラーゼ活性を評価します。穏やかなプレート攪拌によってサンプルを混合し、発光を再度測定して、Renillaルシフェラーゼ活性を評価します。レポーター応答を定量化し、野生型Ube3aに対する各変異体のホタル値とレニラ値を正規化することにより、変異体タンパク質の相対活性を比較します。野生型Ube3aをコードするプラスミドの量を増やしてトランスフェクトしたHEK293T細胞は、BAR応答の直線的な増加を示しています。BARアッセイは、プラスミドの疾患関連変異体を同定し、この方法の精度と一般性を実証します。152のUbe3a変異体のBARアッセイスクリーニングは、野生型Ube3aと比較して良性の機能喪失および機能獲得変異を示しています。Ube3aの588位での機能グルタミン酸置換の獲得、機能プロリン置換の喪失、および別の機能アルギニン置換の喪失は、劇的に異なる効果をもたらし、それによって経験的バリアント評価の重要性を強調しました。ヒートプロットは、Ube3aの位置588での包括的な突然変異分析のための正規化されたBAR結果を示しています。白い網掛けは野生型のUbe3a活性レベルを表し、青い網掛けは機能の喪失を示し、赤い網掛けは機能変異の獲得を示します。私たちの研究の臨床的意味を超えて、Ube3aはユビキチンリガーゼのHECTドメインファミリーのメンバーであり、それらはすべて保存されたHECT触媒ドメインを持っています。そして、私たちの研究の魅力的な側面の1つは、Ube3aに関する豊富な構造関数データを提供することであり、これを使用して、このクラスの酵素のより深いメカニズムの理解を得ることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

神経科学

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

同時MEGおよびEEGとの機能的マッピング

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

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機能性経頭蓋ドップラー超音波を使って子供の脳の側性化の評価（fTCD）

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

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&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

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