Name: a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), en NARSAD Young Investigator Award fra Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), et stipendiat fra Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), og forskningsstipend fra Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.), og NIMH (R01MH122786; JJY).

1. Mutagenesekloning for å generere Ube3a-varianter
<ol><li>Klon alle Ube3a-varianter inn i pCIG2-plasmidet (figur 1A), en bicistronisk vektor som inneholder en kylling-β-aktinpromotor og et internt ribosominngangssted (IRES) for EGFP-uttrykk19. Ube3a-konstruksjoner i full lengde inneholder en N-terminal Myc-tag-sekvens og klones til pCIG2 ved hjelp av et 5' SacI-område og et 3' XmaI-nettsted. I tillegg brukes også nat...

<ol>
	<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype.">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li><li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60,706+humans.">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+interpretation:+Functional+assays+to+the+rescue.">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li><li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53.">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li><li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene,+Ube3a,+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons.">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li><li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Angelman+syndrome+candidate+gene,+UBE3A/E6-AP,+is+imprinted+in+brain.">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li><li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene,+UBE3A,+is+restricted+to+brain.">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li><li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE3A/E6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome.">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li><li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation.">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li><li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome:+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes.">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li><li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13.">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li><li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism,+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature.">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics.">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li><li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECT+E3s+and+human+disease.">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, (2007).</li><li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein.">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li><li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development.">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt/beta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome.">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li><li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis.">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).</li><li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum.">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30 (2011).</li><li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells.">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li><li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+beta-catenin/TCF+transcription+with+beta-catenin/TCF+transcription-based+reporter+constructs.">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A.">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li><li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn(2+)-binding+N-terminal+(AZUL)+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome.">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li><li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+E6-AP+gene+(UBE3A)+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li><li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome.">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li><li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations.">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li></ol>

Protokollen beskrevet her gir en effektiv og skalerbar metode for å vurdere den enzymatiske aktiviteten til Ube3a-varianter. Det er flere tekniske detaljer som krever nøye vurdering når du bruker denne analysen. En vurdering er valget av Wnt-reporterplasmider som brukes i denne analysen. Protokollen som er beskrevet her, bruker spesifikt β-catenin activated reporter (BAR)21, en reporter som inneholder en sammenkobling av 12 T-cellefaktor (TCF) responselementer atskilt av spesielt utfo...

Nylige teknologiske fremskritt har gjort sekvensering av eksomer og genomer rutine i kliniske omgivelser 1,2. Dette har ført til oppdagelsen av et stort antall genetiske varianter, inkludert millioner av missense-varianter som vanligvis endrer en aminosyre i et protein. Å forstå den funksjonelle betydningen av disse variantene er fortsatt en utfordring, og bare en liten brøkdel (~ 2%) av de kjente missense-variantene har en klinisk tolkning 1,3.
Et fremtredende eksempel på dette problemet er Ube3a, et gen som koder for en E3 ubiquitin ligase som retter seg mot substratproteiner for nedbrytning4. Ube3a ligger innenfor kromosom 15q11-13 og uttrykkes utelukkende fra det maternelle arvelige allelet 5,6,7. Observasjoner fra sykdomsgenetikk tyder sterkt på at utilstrekkelig eller overdreven aktivitet av UBE3A-enzymet forårsaker distinkte nevroutviklingsforstyrrelser. Sletting av mors kromosom 15q11-13 forårsaker Angelman syndrom (AS)8, en lidelse preget av alvorlig intellektuell funksjonshemming, motoriske funksjonsnedsettelser, anfall, en lykkelig oppførsel med hyppig smilende og dysmorfe ansiktsegenskaper 8,9,10. I motsetning til dette forårsaker duplisering eller triplikasjon av mors kromosom 15q11-13 Dup15q syndrom, en heterogen tilstand anerkjent som en av de mest utbredte syndromiske former for autisme11,12,13. I tillegg er det identifisert hundrevis av missense-varianter i Ube3a, hvorav de fleste anses som varianter av usikker betydning (VUS) da deres funksjonelle og kliniske signifikans er ukjente. Det er derfor stor interesse for å utvikle metoder som empirisk kan vurdere Ube3a-varianter for å avgjøre om de bidrar til nevroutviklingssykdom.
UBE3A-enzymet tilhører HECT-domenefamilien (homolog til E6-AP C-terminus) av E3 ubiquitin-ligaser som alle har det eponymiske HECT-domenet, som inneholder det biokjemiske maskineriet som er nødvendig for å akseptere aktivert ubiquitin fra E2-enzymer og overføre det til substratproteiner14. Historisk har karakteriseringen av E3-enzymer vært avhengig av rekonstituerte in vitro-systemer som krever et ensemble av rensede proteiner 4,15,16. Slike metoder er langsomme og arbeidsintensive og ikke egnet til å vurdere aktiviteten til et stort antall varianter. I tidligere arbeid ble UBE3A identifisert for å aktivere Wnt-banen i HEK293T-celler ved å modulere proteasomets funksjon for å bremse nedbrytningen av β-catenin17. Denne innsikten gjør det mulig å bruke Wnt-banereportere som en effektiv og rask metode for å identifisere både taps- og gevinst-av-funksjon-varianter av Ube3a18. Protokollen nedenfor beskriver i detalj en metode for å generere Ube3a-varianter, samt en luciferase-basert reporter for å vurdere endringer i aktiviteten til Ube3a-varianter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Kb DNA ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M108-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium Salt</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>KCC46000-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber&#160; slides</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td>
			<td>Intact Genomics</td>
			<td>1011-12</td>
			<td>E. coli DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12643</td>
			<td>Midi prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCIG2 plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL3 BAR plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td>
			<td>Applied biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK Renilla plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Mini prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants

Den økte bruken av sekvensering i medisin har identifisert millioner av kodende varianter i det menneskelige genomet. Mange av disse variantene forekommer i gener assosiert med nevroutviklingsforstyrrelser, men den funksjonelle betydningen av de aller fleste varianter er fortsatt ukjent. Den nåværende protokollen beskriver studiet av varianter for Ube3a, et gen som koder for en E3 ubiquitin ligase knyttet til både autisme og Angelman syndrom. Duplisering eller triplikasjon av Ube3a er sterkt knyttet til autisme, mens slettingen forårsaker Angelman syndrom. Forståelse av valensen av endringer i UBE3A proteinaktivitet er derfor viktig for kliniske utfall. Her beskrives en rask, cellebasert metode som parrer Ube3a-varianter med en Wnt-banereporter. Denne enkle analysen er skalerbar og kan brukes til å bestemme valensen og størrelsen på aktivitetsendringer i en hvilken som helst Ube3a-variant . Videre tillater anlegget av denne metoden generering av et vell av strukturfunksjonsinformasjon, som kan brukes til å få dyp innsikt i de enzymatiske mekanismene til UBE3A.

Storskala funksjonell screening av Ube3a missense-varianter identifiserer et bredt landskap av taps- og gevinst-av-funksjon-mutasjoner Tidligere arbeid med Ube3a-mutanter antydet at Wnt-responsen kan tjene som reporter for cellulær UBE3A-proteinaktivitet. Disse observasjonene ble utvidet, og ytterligere valideringseksperimenter ble utført for å undersøke om BAR-analysen er egnet til å rapportere en rekke UBE3A-aktiviteter i cellen. Først ble HEK293T-celler transfisert med varie...

Watch this Scientific Journal Video about A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants at JoVE.com

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

En enkel og skalerbar metode ble utviklet for å vurdere den funksjonelle betydningen av missense-varianter i Ube3a, et gen hvis tap og gevinst av funksjon er knyttet til både Angelman syndrom og autismespektrumforstyrrelse.

En skalerbar, cellebasert metode for funksjonell vurdering av Ube3a-varianter

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

Vår metode gir en rask måte å forstå den funksjonelle effekten av varianter i Ube3a, en ubiquitin ligase som forårsaker Angelman syndrom og er sterkt knyttet til en genetisk form for autisme kjent som Dup15q syndrom. Karakteriseringen av ubiquitin ligaseaktivitet er tradisjonelt arbeidsintensiv og langsom, og slike metoder er vanskelige og egentlig ikke mottagelige for å karakterisere de hundrevis av varianter som er identifisert for Ube3a. Angelman syndrom er forårsaket av sletting av mors Ube3a-gen, mens Dup15q syndrom er forårsaket av duplisering av mors Ube3a, så det er viktig å utlede hvordan missense-varianter endret aktiviteten til Ube3a-enzymet, og dette er noe som er vanskelig å gjøre uten empirisk testing av hver variant.Demonstrere prosedyren vil være Jalin Stelzer, en forskningstekniker i laboratoriet mitt. Begynn med å utføre analysene i HEK293T-celler, dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium ved 37 grader Celsius, med 5% karbondioksid i en fuktet beholder, som beskrevet i manuskriptet. I et biosikkerhetsskap, plate de suspenderte HEK293T-cellene på en vevskulturbehandlet 96 godt flatbunnet plate og inkubere cellene over natten ved 37 grader.På den andre dagen, transfect cellene i et biosikkerhetsskap med Firefly og Renilla luciferase reporter plasmider, og Ube3a plasmider i tre eksemplarer. Utfør transfeksjonene i et totalt volum på 10 mikroliter per brønn. Lag en masterblanding for transfeksjonene for hver variant i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.Etter inkubasjonen omrøres transfeksjonsblandingen forsiktig ved å tappe røret, og tilsett deretter 10 mikroliter av transfeksjonsblandingen direkte til det eksisterende vekstmediet i brønnene. Etterpå, returner cellene til inkubatoren og la plasmidene uttrykke seg i 48 timer. Ved hjelp av et fluorescensmikroskop, overvåk transfeksjonseffektiviteten ved GFP-fluorescens.Mer enn 80% av cellene skal uttrykke GFP etter 48 timer. Aspirer forsiktig kulturmediet fra transfiserte HEK293T-celler og vask deretter cellene med kald PBS. Aspirer PBS.Tilsett 25 mikroliter ikke-denaturerende lysisbuffer for cellelyse, og inkuber i 15 minutter på is med forsiktig gynging. Tilsett deretter 20 mikroliter av det resulterende lysatet i en ny 96-brønns analyseplate som inneholder 100 mikroliter av et Firefly luciferase substratreagens, og bland platen forsiktig ved å tappe. Legg platen ned til en plateleser og mål luminescensen ved hjelp av en toppdetektor med en lesehøyde på en millimeter og en integrasjonstid på ett sekund.Umiddelbart etter å ha lest Firefly luciferase luminescens, tilsett 100 mikroliter Renilla luciferase substrat til brønnene, som slukker Firefly luciferase-aktiviteten mens du vurderer Renilla luciferaseaktivitet. Bland prøvene ved forsiktig plateomrøring og mål luminescensen igjen for å vurdere Renilla luciferase-aktiviteten. Sammenlign den relative aktiviteten til variantproteiner ved å kvantifisere reporterresponsene og normalisere Firefly og Renilla-verdien for hver variant mot den ville typen Ube3a.HEK293T-celler transfisert med økende mengder plasmidkoding av villtype Ube3a viser en lineær økning i BAR-responsen. BAR-analysen identifiserer sykdomsbundne varianter av plasmidene, og demonstrerer nøyaktigheten og generaliteten til denne metoden. BAR-analyseskjerm for 152 Ube3a-varianter viser godartet funksjonstap og gevinst av funksjonsmutasjoner i forhold til villtype Ube3a.Gevinsten av funksjonsglutamatsubstitusjon, tap av funksjonsprolinsubstitusjon og et annet tap av funksjonsargininsubstitusjon i posisjon 588 i Ube3a ga drastisk forskjellige effekter, og understreket dermed viktigheten av empirisk variantvurdering. Varmeplottet viser normaliserte BAR-resultater for omfattende mutasjonsanalyse i posisjon 588 i Ube3a. Den hvite skyggeleggingen representerer aktivitetsnivåer av villtype Ube3a, den blå skyggeleggingen indikerer tap av funksjon, og den røde skyggeleggingen indikerer gevinst av funksjonsmutasjoner.Utover de kliniske implikasjonene av vårt arbeid, er Ube3a medlem av HECT-domenefamilien av ubiquitin-ligaser, som alle har det bevarte HECT-katalytiske domenet. Og jeg tror en av de fascinerende aspektene ved vårt arbeid er at det gir rike strukturfunksjonsdata om Ube3a, og dette kan brukes til å få en dypere mekanistisk forståelse for denne klassen av enzymer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funksjonell og Morfologisk Vurdering av Membran Innervasjon av phrenic motoriske nerveceller

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Vurdering av hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved bruk av Golgi-Cox-metoden

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: En ny metode for rask Neurite Extension og funksjonell Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Volumetrisk metode for kvantifisering av Cerebral vasospasme i en Murine modell av Hjernehinneblødning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Kraften i Interstimulus intervall for vurdering av timelige behandling i gnagere

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

μTongue: En mikrofluidikkbasert funksjonell bildeplattform for tungen In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...