Name: a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants at JoVE.com

Bu çalışma, Simons Vakfı Bağımsızlık Köprüsü Ödülü (SFARI Ödülü #387972; J.J.Y.), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı'ndan (J.J.Y.) NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Alfred P. Sloan Vakfı'ndan (J.J.Y.) Araştırma Bursu ve Angelman Sendromu Vakfı (J.J.Y.), Whitehall Vakfı (J.J.Y.) ve NIMH'den (R01MH122786; J.J.Y.).

1. Ube3a varyantları üretmek için mutagenez klonlaması
<ol><li>Tüm Ube3a varyantlarını, EGFP ekspresyonu19 için bir tavuk-β-aktin promotörü ve bir iç ribozom giriş bölgesi (IRES) içeren bir bisistronik vektör olan pCIG2 plazmidine (Şekil 1A) klonlayın. Tam uzunluktaki Ube3a yapıları bir N-terminal Myc-tag dizisi içerir ve 5' SacI sitesi ve 3' XmaI sitesi kullanılarak pCIG2'ye klonlanır. Ek olarak, <e...

<ol>
	<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype.">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li><li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60,706+humans.">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+interpretation:+Functional+assays+to+the+rescue.">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li><li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53.">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li><li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene,+Ube3a,+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons.">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li><li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Angelman+syndrome+candidate+gene,+UBE3A/E6-AP,+is+imprinted+in+brain.">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li><li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene,+UBE3A,+is+restricted+to+brain.">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li><li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE3A/E6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome.">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li><li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation.">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li><li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome:+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes.">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li><li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13.">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li><li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism,+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature.">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics.">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li><li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECT+E3s+and+human+disease.">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, (2007).</li><li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein.">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li><li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development.">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt/beta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome.">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li><li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis.">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).</li><li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum.">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30 (2011).</li><li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells.">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li><li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+beta-catenin/TCF+transcription+with+beta-catenin/TCF+transcription-based+reporter+constructs.">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li><li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A.">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li><li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn(2+)-binding+N-terminal+(AZUL)+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome.">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li><li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+E6-AP+gene+(UBE3A)+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li><li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome.">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li><li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations.">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, Ube3a varyantlarının enzimatik aktivitesini değerlendirmek için verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlili kullanırken dikkatli bir şekilde düşünülmesini gerektiren birkaç teknik ayrıntı vardır. Bir husus, bu tahlilde kullanılan Wnt muhabir plazmidlerinin seçimidir. Burada açıklanan protokol, özellikle TCF bağlanma bölgelerinin rekombinasyonunu ve kaybını en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış bağlayıcı dizileriyle ayrılmış 12 T...

Son teknolojik gelişmeler, ekzomların ve genomların dizilimini klinik ortamlarda rutin hale getirmiştir 1,2. Bu, tipik olarak bir proteindeki bir amino asidi değiştiren milyonlarca yanlış anlam varyantı da dahil olmak üzere çok sayıda genetik varyantın keşfedilmesine yol açmıştır. Bu varyantların fonksiyonel önemini anlamak bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bilinen yanlış anlam varyantlarının sadece küçük bir kısmı (~% 2) klinik bir yoruma sahiptir 1,3.
Bu sorunun belirgin bir örneği, yıkım için substrat proteinlerini hedef alan bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a'dır 4. Ube3a, kromozom 15q11-13 içinde bulunur ve sadece maternal kalıtsal alel 5,6,7'den eksprese edilir. Hastalık genetiğinden yapılan gözlemler, UBE3A enziminin yetersiz veya aşırı aktivitesinin farklı nörogelişimsel bozukluklara neden olduğunu kuvvetle göstermektedir. Maternal kromozom 15q11-13'ün silinmesi, ciddi zihinsel engellilik, motor bozukluklar, nöbetler, sık sık gülümseyen mutlu bir tavır ve dismorfik yüz özellikleri 8,9,10 ile karakterize bir bozukluk olan Angelman sendromuna (AS) 8'e neden olur. Buna karşılık, maternal kromozom 15q11-13'ün çoğaltılması veya çoğaltılması, otizmin en yaygın sendromik formlarından biri olarak kabul edilen heterojen bir durum olan Dup15q sendromuna neden olur11,12,13. Ek olarak, Ube3a'da tanımlanan yüzlerce yanlış anlam varyantı vardır, bunların çoğu, fonksiyonel ve klinik önemi bilinmediğinden, belirsiz öneme sahip varyantlar (VUS) olarak kabul edilir. Bu nedenle, nörogelişimsel hastalığa katkıda bulunup bulunmadıklarını belirlemek için Ube3a varyantlarını ampirik olarak değerlendirebilecek yöntemler geliştirmeye büyük ilgi vardır.
UBE3A enzimi, E2 enzimlerinden aktive ubikitini kabul etmek ve substrat proteinlerine aktarmak için gerekli biyokimyasal makineleri içeren isimsiz HECT alanına sahip olan E3 ubikitin ligazlarının HECT (E6-AP C-terminus'a homolog) alan ailesine aittir14. Tarihsel olarak, E3 enzimlerinin karakterizasyonu,saflaştırılmış proteinlerin bir topluluğunu gerektiren yeniden yapılandırılmış in vitro sistemlere dayanmaktadır 4,15,16. Bu tür yöntemler yavaş ve emek yoğundur ve çok sayıda varyantın aktivitesini değerlendirmeye uygun değildir. Önceki çalışmalarda, UBE3A'nın, β-katenin17'nin bozulmasını yavaşlatmak için proteazomun işlevini modüle ederek HEK293T hücrelerinde Wnt yolunu aktive ettiği tespit edildi. Bu içgörü, Wnt yol muhabirlerinin Ube3a18'in hem işlev kaybı hem de kazanç değişkenlerini tanımlamak için verimli ve hızlı bir yöntem olarak kullanılmasına izin verir. Aşağıdaki protokol, Ube3a varyantlarının aktivitesindeki değişiklikleri değerlendirmek için Lusiferaz tabanlı bir muhabirin yanı sıra Ube3a varyantlarını üretmek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Kb DNA ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M108-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Lambda Biotech</td>
			<td>M107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0202A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium Salt</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>KCC46000-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber&#160; slides</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td>
			<td>Intact Genomics</td>
			<td>1011-12</td>
			<td>E. coli DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12643</td>
			<td>Midi prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCIG2 plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL3 BAR plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td>
			<td>Applied biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK Renilla plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Mini prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td>PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a scalable, cell-based method for the functional assessment of ube3a variants

Tıpta dizilemenin artan kullanımı, insan genomunda milyonlarca kodlama varyantı tanımlamıştır. Bu varyantların birçoğu nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genlerde görülür, ancak varyantların büyük çoğunluğunun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Mevcut protokol, hem otizm hem de Angelman sendromuna bağlı bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a için varyantların incelenmesini açıklamaktadır. Ube3a'nın çoğaltılması veya çoğaltılması otizmle güçlü bir şekilde bağlantılıdır, oysa silinmesi Angelman sendromuna neden olur. Bu nedenle, UBE3A protein aktivitesindeki değişikliklerin değerini anlamak, klinik sonuçlar için önemlidir. Burada, Ube3a varyantlarını bir Wnt yol muhabiri ile eşleştiren hızlı, hücre tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit tahlil ölçeklenebilir ve herhangi bir Ube3a varyantındaki aktivite değişikliklerinin değerini ve büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemin tesisi, UBE3A'nın enzimatik mekanizmaları hakkında derin bilgiler edinmek için kullanılabilecek çok sayıda yapı-işlev bilgisinin üretilmesine izin verir.

Ube3a yanlış anlam varyantlarının büyük ölçekli fonksiyonel taraması, fonksiyon kaybı ve kazancı mutasyonlarının geniş bir manzarasını tanımlar. Ube3a mutantları ile yapılan önceki çalışmalar, Wnt yanıtının hücresel UBE3A protein aktivitesinin bir muhabiri olarak hizmet edebileceğini öne sürdü. Bu gözlemler genişletildi ve BAR testinin hücredeki bir dizi UBE3A aktivitesini rapor etmek için uygun olup olmadığını araştırmak için ek doğrulama d...

Watch this Scientific Journal Video about A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants at JoVE.com

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a'daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.

Ube3a Varyantlarının İşlevsel Değerlendirmesi için Ölçeklenebilir, Hücre Tabanlı Bir Yöntem

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

Yöntemimiz, Angelman sendromuna neden olan ve Dup15q sendromu olarak bilinen genetik bir otizm formuyla güçlü bir şekilde bağlantılı olan ubikitin ligaz olan Ube3a'daki varyantların fonksiyonel etkisini anlamak için hızlı bir yol sağlar. Ubikitin ligaz aktivitesinin karakterizasyonu geleneksel olarak emek yoğun ve yavaştır ve bu tür yöntemler zordur ve Ube3a için tanımlanan yüzlerce varyantı karakterize etmek için gerçekten uygun değildir. Angelman sendromu, maternal Ube3a geninin silinmesinden kaynaklanırken, Dup15q sendromu maternal Ube3a'nın çoğaltılmasından kaynaklanır, bu nedenle yanlış değişken varyantların Ube3a enziminin aktivitesini nasıl değiştirdiğini çıkarmak önemlidir ve bu, her varyantı ampirik olarak test etmeden yapılması zor bir şeydir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımda bir araştırma teknisyeni olan Jalin Stelzer olacak. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında 37 santigrat derecede yetiştirilen HEK293T hücrelerinde, makalede açıklandığı gibi, nemlendirilmiş bir kapta% 5 karbondioksit ile tahlilleri yaparak başlayın. Bir biyogüvenlik kabininde, askıya alınmış HEK293T hücrelerini doku kültürü ile işlenmiş 96 iyi düz tabanlı bir plakaya yerleştirin ve hücreleri gece boyunca 37 derecede inkübe edin.İkinci gün, bir biyogüvenlik kabinindeki hücreleri Firefly ve Renilla lusiferaz muhabir plazmidleri ve üçlü olarak Ube3a plazmidleri ile transfekte edin. Transfeksiyonları kuyu başına toplam 10 mikrolitre hacimde gerçekleştirin. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde her varyant için transfeksiyonlar için bir ana karışım oluşturun ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Kuluçkadan sonra, tüpe dokunarak transfeksiyon karışımını hafifçe çalkalayın ve ardından transfeksiyon karışımının 10 mikrolitresini doğrudan kuyucuklardaki mevcut büyüme ortamına ekleyin. Daha sonra, hücreleri inkübatöre geri döndürün ve plazmidlerin 48 saat boyunca eksprese etmesine izin verin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, GFP floresan ile transfeksiyon verimliliğini izleyin.Hücrelerin% 80'inden fazlası 48 saat sonra GFP'yi eksprese etmelidir. Kültür ortamını transfekte HEK293T hücrelerinden dikkatlice aspire edin ve ardından hücreleri soğuk PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin.Hücre lizisi için 25 mikrolitre denatüre olmayan lizis tamponu ekleyin ve hafifçe sallanarak buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, elde edilen lizatın 20 mikrolitresini, 100 mikrolitre Firefly lusiferaz substrat reaktifi içeren yeni bir 96 kuyucuklu tahlil plakasına ekleyin ve plakayı hafifçe dokunarak karıştırın. Plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve bir milimetre okuma yüksekliğine ve bir saniyelik entegrasyon süresine sahip bir üst dedektör kullanarak parlaklığı ölçün.Firefly lusiferaz lüminesansını okuduktan hemen sonra, kuyucuklara 100 mikrolitre Renilla lusiferaz substratı ekleyin, bu da Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirirken Firefly lusiferaz aktivitesini söndürür. Numuneleri nazik plaka ajitasyonu ile karıştırın ve Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için lüminesansı tekrar ölçün. Muhabir yanıtlarını ölçerek ve her varyant için Firefly ve Renilla değerini vahşi tip Ube3a'ya karşı normalleştirerek varyant proteinlerinin göreceli aktivitesini karşılaştırın.Artan miktarlarda plazmid kodlaması ile transfekte edilen HEK293T hücreleri, vahşi tip Ube3a, BAR yanıtında doğrusal bir artış göstermektedir. BAR testi, plazmidlerin hastalığa bağlı varyantlarını tanımlar ve bu yöntemin doğruluğunu ve genelliğini gösterir. 152 Ube3a varyantı için BAR tahlil ekranı, vahşi tip Ube3a'ya göre iyi huylu fonksiyon kaybını ve fonksiyon mutasyonlarının kazanımını gösterir.Fonksiyon glutamat ikamesinin kazanılması, fonksiyon kaybı prolin ikamesi ve Ube3a'nın 588 pozisyonundaki başka bir fonksiyon arginin ikamesi kaybı, büyük ölçüde farklı etkiler üretmiş ve böylece ampirik varyant değerlendirmesinin önemini vurgulamıştır. Isı grafiği, Ube3a'da 588 konumunda kapsamlı mutasyon analizi için normalleştirilmiş BAR sonuçlarını göstermektedir. Beyaz gölgelendirme vahşi tip Ube3a aktivite seviyelerini, mavi gölgelendirme fonksiyon kaybını ve kırmızı gölgelendirme fonksiyon mutasyonlarının kazanımını gösterir.Çalışmamızın klinik sonuçlarının ötesinde, Ube3a, hepsi korunmuş HECT katalitik alana sahip olan ubikitin ligazlarının HECT alan ailesinin bir üyesidir. Ve bence çalışmamızın büyüleyici yönlerinden biri, Ube3a hakkında zengin yapı fonksiyonu verileri sağlaması ve bu, bu enzim sınıfı için daha derin bir mekanik anlayış kazanmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Eşzamanlı MEG ve EEG Fonksiyonel Haritalama

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

Fonksiyonel Transkraniyal Doppler Ultrasonografi kullanarak Çocuklarda Serebral Lateralizasyon Değerlendirme (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Interstimulus Aralık kemirgenler zamansal işleme değerlendirilmesi için güç

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...