Name: evaluation of the spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00
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Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal National Institutes of Health (R35GM136340 a KS).

Tutti i topi utilizzati in questi protocolli sono stati ospitati e allevati secondo il Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali della Rutgers University (protocollo 201702497) e le linee guida del National Institutes of Health. Questi organismi di regolamentazione hanno approvato tutte le procedure sperimentali che coinvolgono studi sugli animali. Tutti i topi utilizzati nel presente studio erano femmine CF-1 di 6-8 settimane.
1. Preparazione sperimentale
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<ol>
	<li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span.">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics.">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).</li><li>London, N., Biggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+the+spindle+checkpoint+response.">Signalling dynamics in the spindle checkpoint response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).</li><li>Kuhn, J., Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+kinetochores+count+attached+microtubules+in+a+sensitive+and+switch-like+manner.">Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner.</a> Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes.">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li><li>Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-specific+differences+in+cell-cycle+control+create+an+innate+susceptibility+to+meiotic+errors.">Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors.</a> Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).</li><li>Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+response+to+unaligned+chromosomes+in+mammalian+female+gametes.">Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro.">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).</li><li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity.">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li><li>Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+oocytes+to+assess+human+gene+function+during+meiosis+I.">Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).</li><li>Herbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologue+disjunction+in+mouse+oocytes+requires+proteolysis+of+securin+and+cyclin+B1.">Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1.</a> Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).</li><li>Solc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+requirements+of+PLK1+during+Mouse+oocyte+maturation.">Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation.</a> PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).</li><li>Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+integrity+of+the+meiotic+spindle+assembly+checkpoint+in+females+requires+Aurora+kinase+B.">Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B.</a> Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age-dependent+APC/C-mediated+decrease+in+securin+causes+premature+sister+chromatid+separation+in+meiosis+II.">Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II.</a> Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).</li><li>Blengini, C. S., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+technique+to+detect+subcellular+structures+critical+to+oocyte+maturation.">Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics.">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li><li>Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+I+arrest+upon+activation+of+the+Mad2-dependent+spindle+checkpoint+in+mouse+oocytes.">Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes.</a> Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).</li><li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes.">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li><li>Homer, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).</li><li>Blengini, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+A+is+essential+for+meiosis+in+mouse+oocytes.">Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes.</a> PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).</li><li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC/C+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1.">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li><li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion.">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li></ol>

Il checkpoint di assemblaggio del mandrino è un meccanismo di controllo critico durante la divisione cellulare progettato per prevenire errori di segregazione cromosomica. Consente alla cellula di avere abbastanza tempo per correggere gli attacchi KT-MT impropri. La meiosi negli ovociti è un processo soggetto a errori, in cui la maggior parte della mis-segregazione cromosomica si verifica durante la meiosi I, portando alla generazione di uova aneuploidi che sono la principale causa di aborti precoci e infertilità nell...

L'aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi1. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi2.
Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo di sorveglianza che mette in pausa il ciclo cellulare, chiamato checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo rileva gli attaccamenti cinetocomeri-microtubuli (MT) e la tensione viene generata quando i cromosomi sono orientati in modo bipolare3. I cinetocori non collegati innescano una risposta SAC che inizia con il reclutamento di MPS1, il regolatore principale del SAC, ai cinetocori 3,4. MPS1 avvia il reclutamento di altri componenti SAC, fungendo da piattaforma per formare il complesso del checkpoint mitotico (MCC). L'MCC, composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, si diffonde nel citoplasma e inibisce l'attivazione di APC/C sequestrando il suo attivatore CDC20. Una volta che tutti i cinetocori sono stabilmente attaccati alle MT e i cromosomi sono allineati alla piastra metafase, il SAC viene silenziato e l'MCC si smonta e rilascia CDC20, consentendo così l'attivazione APC / C. L'APC/C attivo degrada Securin e Cyclin B, due passaggi chiave per innescare l'insorgenza dell'anafase 5,6. Nelle cellule somatiche, il SAC è rigoroso perché è attivato da un singolo cinetocore non attaccato ed è sufficiente per indurre l'arresto del ciclo cellulare6. Tuttavia, durante la meiosi ovocitaria, il SAC è più permissivo e gli ovociti possono entrare in anafase I con uno o più cinetocori non attaccati 6,7,8,9,10. Capire perché il SAC è più permissivo negli ovociti è un'area di interesse costante nel campo. I meccanismi che causano difetti nell'attivazione del SAC o nel silenziamento del SAC potrebbero portare a errori nella segregazione cromosomica o all'arresto prolungato del ciclo cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, valutare i meccanismi che mantengono l'integrità del SAC negli ovociti è importante per comprendere il processo di formazione di uova sane ed euploidi.
Questo protocollo descrive le tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC nella meiosi degli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici del checkpoint. In primo luogo, viene descritta la valutazione della risposta SAC dopo aver indotto l'attivazione del SAC. Questa attivazione si ottiene generando cinetocori non attaccati utilizzando nocodazolo, un farmaco che depolimerizza MTs11. In secondo luogo, un metodo per monitorare il silenziamento del SAC è descritto monitorando la dinamica della degradazione della Securin durante la maturazione degli ovociti. Infine, un saggio basato sull'immunofluorescenza viene impiegato per misurare il reclutamento di MAD2, uno dei componenti MCC, nei cinetori. Insieme, questi test valutano in modo completo l'integrità del SAC durante la maturazione meiotica degli ovociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti-rabbit-Alexa-568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-human-Alexa-633</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-ACA</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234</td>
			<td>Dilution 1/30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 equipped with a 63&#215;, 1.40 NA oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldhyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- MAD2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>924601</td>
			<td>Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes

L'aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l'aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all'aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell'assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l'MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l'anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l'APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l'insorgenza dell'anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l'uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell'integrità del SAC.

Valutazione della risposta al SAC mediante trattamento con nocodazolo Lo scopo di questo esperimento è valutare l'attivazione e la forza del SAC. Utilizzando il nocodazolo per depolimerizzare i microtubuli del fuso, tutti i cinetocori saranno scollegati, il che causerà un arresto del ciclo cellulare mediato da SAC. Nell'attuale sistema di imaging, gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone (Figura 1</stron...

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Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

L'aneuploidia è la principale causa genetica di aborto spontaneo precoce negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica si verificano durante la meiosi negli ovociti. Pertanto, la valutazione del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti è fondamentale per capire perché gli ovociti sono soggetti a errori.Qui descriviamo tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici al checkpoint utilizzando una combinazione di imaging dal vivo e immunofluorescenza. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Cecilia Blengini, ricercatrice associata del mio laboratorio. Per iniziare preparare un millilitro di terreno di coltura contenente nocodazolo e reversine con DMSO come controllo come descritto nel manoscritto.Per la maturazione degli ovociti e l'imaging dal vivo utilizzare una piastra preriscaldata a 96 pozzetti in un'incubatrice. E caricare il primo, il secondo e il terzo pozzo con 150 microlitri del controllo DMSO, nocodazolo e nocodazolo più trattamento reversine rispettivamente. Mantenendo la lastra nell'incubatore nelle condizioni descritte nel manoscritto.Per iniziare la maturazione miotica, rimuovere milrinone trasferendo sequenzialmente gli ovociti attraverso 6 gocce di 100 microlitri di terreni di coltura liberi da milrinone contenenti DMSO. E mettili nel pozzetto corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Uso di una pipetta azionata a mano o a bocca durante la visualizzazione degli ovociti al microscopio stereo.Visualizzare gli ovociti utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di una camera di incubatrice con un ambiente controllato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 80% di umidità. Acquisire immagini sul piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore. Dopo aver quantificato il numero di ovociti che estrudono un corpo polare identificando le cellule che attraversano citochine asimmetriche con una piccola cellula accanto all'uovo e all'interno della zona pellucida condivisa.Visualizza le immagini utilizzando il software di imaging. Microiniettare ovociti arrestati pro-fase uno con 100 nanogrammi per microlitri di cRNA securin-gfp precedentemente preparato. Dopo la microiniezione, lasciare che gli ovociti recuperino e traducano l'RNA nell'incubatore di anidride carbonica per almeno tre ore.Quindi caricare 150 microlitri di terreni di coltura con o senza cinque micromolari di nocodazolo. E 150 microlitri di terreno di coltura con 0,5 micromolari di reversine in tre diversi pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Lavare gli ovociti microiniettati attraverso sei gocce di terreno di coltura libero da milrinone E trasferire un terzo degli ovociti in ogni trattamento.Tenere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e l'80% di umidità fino a quando gli ovociti non riprendono la meiosi, circa tre ore dopo il lavaggio del milrinone. Registrare immagini della maturazione degli ovociti utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una camera di incubatrice. Utilizzare software di analisi delle immagini per quantificare la distruzione securin-gfp e aprire le immagini del canale GFP, a partire dal tempo 0.1.Nel software di analisi preferito, utilizzare lo strumento selezione o forma per contrassegnare ogni ovocita e generare una regione di interesse per ogni cellula. Utilizza la stessa area di interesse per selezionare un'area di sfondo da sottrarre in seguito e misurare l'intensità dei pixel GFP in ogni regione di interesse in tutti i punti temporali. Infine, ad ogni valore GFP, sottrarre la misura della regione di interesse sullo sfondo.Dopo aver diviso la meiosi in tre gruppi, trasferire ciascun gruppo di meiosi in gocce da 100 microlitri di terreni di coltura liberi da milrinone. Coprire le gocce con olio minerale e metterle nell'incubatore per tre, cinque e sette ore per raggiungere rispettivamente la fase di prometafase uno, la prometafase uno tardiva e la fase di metafase uno. Nei punti temporali assegnati, fissare gli ovociti trasferendoli in gocce da 500 microlitri di paraformaldeide al 2% in tampone PME per 20 minuti a temperatura ambiente utilizzando un piatto di vetro a nove pozzetti.Quindi trasferire le cellule in un pozzetto pulito contenente una goccia da 500 microlitri di soluzione bloccante. Per continuare la rilevazione MAD2, trasferire gli ovociti in un pozzetto pulito contenente una goccia da 500 microlitri di soluzione di permeabilizzazione. Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, trasferire le cellule in un nuovo pozzetto di soluzione bloccante e incubare per 10 minuti.Trasferire gli ovociti in una goccia da 30 microlitri di soluzione bloccante con anticorpo anti-MAD2 e anticorpo anti-centromero e incubare per due ore a temperatura ambiente. Per lavare gli anticorpi primari in eccesso dopo aver trasferito le cellule a 30 microlitri di tampone PME integrato con Tritone 0,5%, incubare per 10 minuti nella camera umidificata. Trasferire le cellule in una goccia da 30 microlitri di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari come anti-umano 633 e anti-coniglio 568.E incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per montare le celle sul vetrino del microscopio, trasferire le cellule su una goccia da 10 microlitri di supporto di montaggio contenente DAPI. Aggiungi piccoli punti di vaselina ad ogni angolo del foglietto di copertina.Posizionarli con cautela sopra la goccia del supporto di montaggio e premere lentamente per distribuire. Sigillare la sottoveste di copertura sulla diapositiva con smalto trasparente. Cinetocori di immagini utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo 40 o 63X.E utilizzando il segnale anticorpale anti-centromero determinare la gamma Z che consente l'imaging dell'intera area cromosomica. Gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone. Dopo l'attivazione del SAC, gli ovociti trattati con nocodazolo sono stati arrestati nella prima metafase e non hanno estrudito un corpo polare.Tuttavia, in assenza di attivazione SAC, gli ovociti hanno estruso un corpo polare nonostante non avessero attaccamenti microtubuli cinetocori. È stato valutato il tasso di degradazione della securina-gfp durante la maturazione miotica. In cui l'intensità di controllo degli ovociti trattati con DMSO inizia a diminuire a circa 10 ore dopo il washout del milrinone.Quando gli ovociti sono stati maturati in presenza dell'agente attivante SAC, nocodazolo, i livelli di securina-gfp erano stabili durante l'intero periodo di maturazione miotica. Al contrario, quando si previene l'attivazione del SAC con il trattamento reversino, il pattern securina-gfp accelera e la degradazione inizia circa quattro ore dopo il washout del milrinone coerente con l'inibizione del SAC. L'imaging confocale è stato impiegato per rilevare centromeri e MAD2 di ovociti maturati all'inizio della prometafase uno, alla prometafase uno tardiva e alla metafase uno.Per valutare la forza del segnale SAC, è stata quantificata l'intensità dei pixel MAD2 localizzata cinetocora. Livelli significativi di reclutamento di MAD2 nei cinetocori si verificano nella prima prometafase uno, quando la maggior parte dei cinetocori non erano attaccati ai microtubuli. I livelli di MAD2 si sono ridotti nella prometafase successiva ed erano quasi assenti alla metafase uno, quando tutti i cinetocori erano stabilmente attaccati ai microtubuli.È importante sottolineare che ognuna di queste tecniche ha i suoi limiti e la sua interpretazione. E suggeriamo di eseguire una combinazione di questi metodi per valutare l'integrità del SAC. Questi tre saggi consentono ai ricercatori di valutare la severità del sacco negli ovociti fornendo informazioni su una potenziale causa di aneuploidia nelle uova umane.

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