Name: evaluation of the spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00
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O financiamento para este projeto foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (R35GM136340 para KS).

Todos os ratos utilizados nesses protocolos foram alojados e criados de acordo com o Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Rutgers (Protocolo 201702497) e as diretrizes do National Institutes of Health. Esses órgãos reguladores aprovaram todos os procedimentos experimentais envolvendo estudos em animais. Todos os camundongos utilizados no presente estudo foram fêmeas com FC-1 de 6-8 semanas de idade.
1. Preparação experimental
<ol><li>Antes d...

<ol>
	<li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span.">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics.">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).</li><li>London, N., Biggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+the+spindle+checkpoint+response.">Signalling dynamics in the spindle checkpoint response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).</li><li>Kuhn, J., Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+kinetochores+count+attached+microtubules+in+a+sensitive+and+switch-like+manner.">Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner.</a> Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes.">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li><li>Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-specific+differences+in+cell-cycle+control+create+an+innate+susceptibility+to+meiotic+errors.">Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors.</a> Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).</li><li>Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+response+to+unaligned+chromosomes+in+mammalian+female+gametes.">Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro.">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).</li><li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity.">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li><li>Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+oocytes+to+assess+human+gene+function+during+meiosis+I.">Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).</li><li>Herbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologue+disjunction+in+mouse+oocytes+requires+proteolysis+of+securin+and+cyclin+B1.">Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1.</a> Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).</li><li>Solc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+requirements+of+PLK1+during+Mouse+oocyte+maturation.">Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation.</a> PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).</li><li>Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+integrity+of+the+meiotic+spindle+assembly+checkpoint+in+females+requires+Aurora+kinase+B.">Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B.</a> Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age-dependent+APC/C-mediated+decrease+in+securin+causes+premature+sister+chromatid+separation+in+meiosis+II.">Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II.</a> Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).</li><li>Blengini, C. S., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+technique+to+detect+subcellular+structures+critical+to+oocyte+maturation.">Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics.">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li><li>Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+I+arrest+upon+activation+of+the+Mad2-dependent+spindle+checkpoint+in+mouse+oocytes.">Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes.</a> Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).</li><li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes.">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li><li>Homer, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).</li><li>Blengini, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+A+is+essential+for+meiosis+in+mouse+oocytes.">Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes.</a> PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).</li><li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC/C+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1.">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li><li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion.">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li></ol>

O ponto de verificação de montagem do fuso é um mecanismo de controle crítico durante a divisão celular projetado para evitar erros de segregação cromossômica. Ele permite que a célula tenha tempo suficiente para corrigir anexos KT-MT inadequados. A meiose em oócitos é um processo propenso a erros, onde a maior parte da segregação incorreta cromossômica ocorre durante a meiose I, levando à geração de óvulos aneuploides que são a principal causa de abortos espontâneos precoces e infertilidade em humano...

A aneuploidia, que surge de erros na segregação cromossômica, é a principal causa de abortos espontâneos precoces e está altamente ligada a erros na meiose1. A meiose é distinta da mitose porque consiste em duas rodadas de divisão celular sem uma etapa intermediária de replicação do DNA. Na meiose I, os cromossomos homólogos se separam, enquanto as cromátides irmãs permanecem juntas. Nos ovócitos, essa etapa é propensa a erros, levando à produção de óvulos aneuploides2.
Para evitar erros de segregação cromossômica, a maioria dos tipos de células ativa um mecanismo de vigilância que pausa o ciclo celular, chamado de ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Esse mecanismo detecta os anexos cinetócoro (KT)-microtúbulo (MT) e a tensão é gerada quando os cromossomos são orientados de maneira bipolar3. Os cinetocoros não anexados desencadeiam uma resposta SAC que começa com o recrutamento do MPS1, o regulador mestre do SAC, para os cinetocoros 3,4. O MPS1 inicia o recrutamento de outros componentes do SAC, atuando como uma plataforma para formar o complexo de ponto de verificação mitótico (CCM). O CCM, composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, difunde-se no citoplasma e inibe a ativação da APC/C sequestrando seu ativador CDC20. Uma vez que todos os cinetocoros estão estáveis ligados aos MTs e os cromossomos estão alinhados na placa de metáfase, o SAC é silenciado e o MCC desmonta e libera o CDC20, permitindo assim a ativação do APC/C. A APC/C ativa degrada a Securin e a Ciclina B, dois passos fundamentais no desencadeamento do início da anáfase 5,6. Nas células somáticas, o SAC é rigoroso porque é ativado por um único cinetócoro desanexado e é suficiente para induzir a parada do ciclo celular6. Entretanto, durante a meiose dos ovócitos, o SAC é mais permissivo, e os ovócitos podem entrar na anáfase I com um ou mais cinetocoros não ligados 6,7,8,9,10. Entender por que o SAC é mais permissivo em ovócitos é uma área contínua de foco no campo. Mecanismos que causam defeitos na ativação do SAC ou silenciamento do SAC podem levar a erros na segregação cromossômica ou parada prolongada do ciclo celular e morte celular. Portanto, avaliar os mecanismos que mantêm a integridade do SAC em oócitos é importante para entender o processo de formação de ovos euploides saudáveis.
Este protocolo descreve técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC na meiose de ovócitos de camundongos, examinando diferentes etapas críticas do ponto de verificação. Primeiramente, descreve-se a avaliação da resposta do SAC após a indução da ativação do SAC. Essa ativação é obtida por meio da geração de cinetocoros desanexados utilizando nocodazol, fármaco que despolimeriza MTs11. Em segundo lugar, um método para monitorar o silenciamento de SAC é descrito rastreando a dinâmica da degradação de Securin durante a maturação de ovócitos. Finalmente, um ensaio baseado em imunofluorescência é empregado para medir o recrutamento de MAD2, um dos componentes do CCM, para cinetocoros. Juntos, esses ensaios avaliam de forma abrangente a integridade do SAC durante a maturação meiótica dos ovócitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti-rabbit-Alexa-568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-human-Alexa-633</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-ACA</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234</td>
			<td>Dilution 1/30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 equipped with a 63&#215;, 1.40 NA oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldhyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- MAD2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>924601</td>
			<td>Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes

A aneuploidia é a principal anormalidade genética que causa aborto espontâneo precoce e falha na gravidez em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica que dão origem à aneuploidia ocorre durante a meiose em ovócitos, mas por que a meiose de ovócitos é propensa a erros ainda não é totalmente compreendida. Durante a divisão celular, as células evitam erros na segregação cromossômica ativando o ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Este mecanismo de controle baseia-se na detecção de ligações cinetócoro-microtúbulo (MT) e na detecção da tensão gerada pelas fibras do fuso. Quando os KTs são desconectados, o SAC é ativado e impede a progressão do ciclo celular. O SAC é ativado primeiramente pela MPS1 quinase, que desencadeia o recrutamento e a formação do complexo de pontos de verificação mitóticos (CCM), composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Em seguida, o CCM se difunde no citoplasma e sequestra o CDC20, um ativador de complexo/ciclossomo promotor de anáfases (APC/C). Uma vez que os KTs se ligam aos microtúbulos e os cromossomos são alinhados na placa metafásica, o SAC é silenciado, o CDC20 é liberado e o APC/C é ativado, desencadeando a degradação da ciclina B e da securina, permitindo assim o início da anáfase. Em comparação com as células somáticas, o SAC nos oócitos não é tão eficaz porque as células podem sofrer anáfase, apesar de terem KTs desligados. Entender por que o SAC é mais permissivo e se essa permissividade é uma das causas dos erros de segregação cromossômica nos oócitos ainda precisa de mais investigação. O presente protocolo descreve as três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em ovócitos de camundongos. Essas técnicas incluem o uso de nocodazol para despolimerizar MTs para avaliar a resposta do SAC, o rastreamento do silenciamento do SAC seguindo a cinética da destruição da Securin e a avaliação do recrutamento de MAD2 para KTs por imunofluorescência. Juntas, essas técnicas investigam os mecanismos necessários para produzir óvulos saudáveis, fornecendo uma avaliação completa da integridade do SAC.

Avaliação da responsividade do SAC pelo tratamento com nocodazol O objetivo deste experimento é avaliar a ativação e a força do SAC. Ao usar nocodazol para despolimerizar os microtúbulos fusiformes, todos os cinetocoros serão desligados, o que causará uma parada do ciclo celular mediada por SAC. No presente sistema de imagem, os oócitos controle tratados com DMSO extruderam um corpo polar por volta de 14 h após a liberação da milrinona (Figura 1, painéis sup...

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Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

A aneuploidia é a principal causa genética de aborto espontâneo precoce em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica ocorre durante a meiose nos ovócitos. Portanto, avaliar o ponto de verificação de montagem do fuso em oócitos é fundamental para entender por que os oócitos são propensos a erros.Aqui descrevemos três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em oócitos de camundongos, examinando diferentes etapas críticas no ponto de verificação usando uma combinação de imagens vivas e imunofluorescência. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Cecilia Blengini, pesquisadora associada do meu laboratório. Iniciar o preparo de um mililitro de meio de cultura contendo nocodazol e reversina com DMSO como controle, conforme descrito no manuscrito.Para a maturação dos ovócitos e imagens vivas, use uma placa pré-aquecida de 96 poços em uma incubadora. E carregar o primeiro, segundo e terceiro poço com 150 microlitros do controle DMSO, nocodazol e nocodazol mais tratamento com reversina, respectivamente. Mantendo a placa na incubadora sob as condições descritas no manuscrito.Para iniciar a maturação miótica, remova a milrinona transferindo sequencialmente os ovócitos através de 6 gotas de 100 microlitros de meio de cultura livre de milrinona contendo DMSO. E coloque-os no poço correspondente da placa de 96 poços. Usando uma pipeta operada à mão ou à boca ao visualizar os oócitos sob um microscópio estéreo.Fotografe os ovócitos usando um microscópio de campo brilhante equipado com uma câmara de incubadora com um ambiente controlado a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 80% de umidade. Capturar imagens no plano médio dos ovócitos em intervalos de 20 minutos por 24 horas. Depois de quantificar o número de ovócitos que extrudem um corpo polar, identificando as células que passam por citocinas assimétricas com uma pequena célula ao lado do óvulo e dentro da zona pelúcida compartilhada.Visualize as imagens usando o software de imagem. Microinjetar oócitos presos pró-fase um com 100 nanogramas por microlitros de cRNA securin-gfp previamente preparado. Após a microinjeção, permita que os oócitos recuperem e traduzam o RNA na incubadora de dióxido de carbono por pelo menos três horas.Em seguida, carregue 150 microlitros de meios de cultura com ou sem cinco micromolares de nocodazol. E 150 microlitros de meios de cultura com 0,5 micromolar de reversina em três poços diferentes de uma placa de 96 poços. Lave os ovócitos microinjetados através de seis gotas de meios de cultura livres de milrinona E transfira um terço dos ovócitos para cada tratamento.Mantenha a placa na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 80% de humidade até que os ovócitos retomem a meiose, cerca de três horas após a lavagem da milrinona. Registrar imagens de maturação de ovócitos usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmara de incubadora. Use um software de análise de imagem para quantificar a destruição do securin-gfp e abra as imagens do canal GFP, a partir do tempo 0.1.No software de análise preferido, use a ferramenta de seleção ou forma para marcar cada ovócito e gerar uma região de interesse para cada célula. Use a mesma região de interesse para selecionar uma área de plano de fundo a ser subtraída posteriormente e medir a intensidade de pixels GFP em cada região de interesse em todos os pontos de tempo. Por fim, para cada valor de GFP, subtraia a medição da região de interesse em segundo plano.Depois de dividir a meiose em três grupos, transfira cada grupo de meiose para 100 gotas de microlitros de meio de cultura livre de milrinona. Cubra as gotas com óleo mineral e coloque-as na incubadora por três, cinco e sete horas para atingir o estágio inicial da prometáfase um, a prometáfase tardia um e a metáfase um, respectivamente. Nos pontos de tempo designados, fixe os ovócitos transferindo-os para gotas de 500 microlitros de paraformaldeído a 2% em tampão PME por 20 minutos à temperatura ambiente usando um prato de vidro de nove poços.Em seguida, transfira as células para um poço limpo contendo uma gota de 500 microlitros de solução de bloqueio. Para continuar a detecção de MAD2, transfira os oócitos para um poço limpo contendo uma gota de 500 microlitros de solução de permeabilização. Depois de incubar por 20 minutos à temperatura ambiente, transferir as células para um novo poço de solução de bloqueio e incubar por 10 minutos.Transfira os ovócitos para uma gota de 30 microlitros de solução bloqueadora com anticorpo anti-MAD2 e anticorpo anticentrômero e incube por duas horas à temperatura ambiente. Para lavar o excesso de anticorpos primários após a transferência das células para 30 microlitros gota de tampão PME suplementado com 0,5%Triton, incubar por 10 minutos na câmara umidificada. Transfira as células para uma gota de 30 microlitros de solução bloqueadora contendo anticorpos secundários, como anti-humano 633 e anti-coelho 568.E incubar por uma hora à temperatura ambiente. Para montar as células na lâmina do microscópio, transfira as células para uma gota de 10 microlitros de meio de montagem contendo DAPI. Adicione pequenos pontos de vaselina a cada canto da tampa.Coloque-os cuidadosamente em cima da gota de mídia de montagem e pressione lentamente para distribuir. Sele a tampa deslize para a lâmina usando esmalte claro. Imagem cinetocoros usando um microscópio confocal equipado com uma objetiva 40 ou 63 X.E usando o sinal de anticorpos anticentrômeros determinar a faixa Z que permite a imagem de toda a área cromossômica. Os ovócitos controle tratados com DMSO extruderam um corpo polar cerca de 14 horas após a liberação da milrinona. Após a ativação do SAC, os ovócitos tratados com nocodazol foram presos na metáfase um e não extruderam um corpo polar.No entanto, na ausência de ativação do SAC, os ovócitos extruderam um corpo polar, apesar de não terem ligações de microtúbulos de cinetócoro. A taxa de degradação da securina-gfp durante a maturação miótica foi avaliada. Em que a intensidade de securina-gfp dos ovócitos tratados com DMSO de controle começa a diminuir aproximadamente 10 horas após o washout da milrinona.Quando os ovócitos foram amadurecidos na presença do agente ativador do SAC, nocodazol, os níveis de securina-gfp permaneceram estáveis durante todo o período de maturação miótica. Em contraste, ao prevenir a ativação do SAC com tratamento de reversina, o padrão securina-gfp acelerou e a degradação começou aproximadamente quatro horas após o washout da milrinona consistente com a inibição do SAC. A imagem confocal foi empregada para detectar centrômeros e MAD2 de oócitos maturados para prometáfase inicial um, prometáfase tardia um e metáfase um.Para avaliar a força do sinal SAC, quantificou-se a intensidade de pixel MAD2 localizada em cinetócoro. Níveis significativos de recrutamento de MAD2 para cinetocoros ocorrem no início da prometáfase um, quando a maioria dos cinetocoros não estava ligada aos microtúbulos. Os níveis de MAD2 reduziram na prometáfase posterior e estavam quase ausentes na metáfase um, quando todos os cinetocoros estavam estáveis ligados aos microtúbulos.É importante destacar que cada uma dessas técnicas tem suas limitações e sua interpretação. E sugerimos a realização de uma combinação desses métodos para avaliar a integridade do SAC. Estes três ensaios permitem que os pesquisadores avaliem a rigidez do saco em ovócitos, dando uma visão sobre uma causa potencial de aneuploidia em ovos humanos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...