1.7K Views
•
10:09 min
•
September 13th, 2022
DOI :
September 13th, 2022
•0:05
Introduction
0:51
Nocodazole Treatment and Live Imaging
2:41
Monitoring the Pattern of Securin-GFP Degradation During Meiotic Maturation
4:42
Recruitment of MAD2 at Kinetochores by Immunofluorescence During Meiotic Maturation
7:26
Results: Evaluating Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes
9:33
Conclusion
Transcript
Aneuploidi er den førende genetiske årsag til tidlig abort hos mennesker. De fleste fejl i kromosomadskillelse forekommer under meiose i oocytter. Derfor er evaluering af spindelsamlingskontrolpunktet i oocytter afgørende for at forstå, hvorfor oocytter er udsat for fejl.
Her beskriver vi tre teknikker til omfattende evaluering af SAC-integritet i museoocytter ved at undersøge forskellige kritiske trin ved checkpoint ved hjælp af en kombination af levende billeddannelse og immunofluorescens. Demonstration af proceduren vil være Dr. Cecilia Blengini, en forskningsassistent fra mit laboratorium. Til at begynde med forberede en milliliter kulturmedier indeholdende nocodazol og reversin med DMSO som en kontrol som beskrevet i manuskriptet.
Til oocytmodning og levende billeddannelse anvendes en forvarmet 96-brøndplade i en inkubator. Og læg den første, anden og tredje brønd med henholdsvis 150 mikroliter af kontrollen DMSO, nocodazol og nocodazol plus reversinbehandling. Mens pladen opbevares i inkubatoren under de betingelser, der er beskrevet i manuskriptet.
For at starte myotisk modning skal du fjerne milrinon ved sekventielt at overføre oocytterne gennem 6 dråber 100 mikroliter milrinonfrie kulturmedier indeholdende DMSO. Og læg dem i den tilsvarende brønd på 96-brøndpladen. Brug af en hånd- eller mundbetjent pipette, mens du ser oocytterne under et stereomikroskop.
Billede oocytterne ved hjælp af et lysfeltmikroskop udstyret med et inkubatorkammer med et kontrolleret miljø ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 80% fugtighed. Tag billeder på oocytternes midterplan med intervaller på 20 minutter i 24 timer. Efter kvantificering af antallet af oocytter, der ekstruderer et polært legeme ved at identificere cellerne, der går gennem asymmetriske cytokiner med en lille celle ved siden af ægget og inden for den delte zona pellucida.
Se billederne ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Microinject pro-fase en arresterede oocytter med 100 nanogram pr. Mikroliter tidligere fremstillet securin-gfp cRNA. Efter mikroinjektion skal oocytterne genvindes og oversættes RNA'et i kuldioxidinkubatoren i mindst tre timer.
Læg derefter 150 mikroliter kulturmedier med eller uden fem mikromolære nocodazol. Og 150 mikroliter kulturmedier med 0,5 mikromolar reversin i tre forskellige brønde i en 96-brøndplade. Vask de mikroinjicerede oocytter gennem seks dråber milrinonfrie kulturmedier Og overfør en tredjedel af oocytterne til hver behandling.
Hold pladen i inkubatoren ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og 80% fugtighed, indtil oocytterne genoptager meiose, cirka tre timer efter milrinonvask. Optag billeder af oocytmodning ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et inkubatorkammer. Brug billedanalysesoftware til at kvantificere sekurin-gfp-ødelæggelse og åbn billederne af GFP-kanalen, startende på tidspunktet 0.1.
I den foretrukne analysesoftware skal du bruge markerings- eller formværktøjet til at markere hver oocyt og generere et interesseområde for hver celle. Brug det samme interesseområde til at vælge et baggrundsområde, der skal trækkes fra senere, og mål GFP-pixelintensiteten i hvert interesseområde på alle tidspunkter. Endelig til hver GFP-værdi trækkes målingen af interesseområdet i baggrunden.
Efter opdeling af meiose i tre grupper overføres hver gruppe meiose til 100 mikroliter dråber milrinonfrie kulturmedier. Dæk dråberne med mineralolie og læg dem i inkubatoren i tre, fem og syv timer for at nå henholdsvis den tidlige prometafase et, sen prometafase et og metafase et trin. På de tildelte tidspunkter fastgøres oocytterne ved at overføre dem til 500 mikroliter dråber 2% paraformaldehyd i PME-buffer i 20 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en ni-brønds glasskål.
Overfør derefter cellerne til en ren brønd indeholdende en 500 mikroliter dråbe blokeringsopløsning. For at fortsætte MAD2-detektion overføres oocytterne til et rent hul, der indeholder en 500 mikroliter dråbe permeabiliseringsopløsning. Efter inkubation i 20 minutter ved stuetemperatur overføres cellerne til en ny blokeringsopløsning og inkuberes i 10 minutter.
Overfør oocytterne til en 30 mikroliter dråbe blokerende opløsning med anti-MAD2-antistof og anticentromerantistof og inkuber i to timer ved stuetemperatur. For at vaske overskydende primære antistoffer efter overførsel af cellerne til 30 mikroliter dråbe PME-buffer suppleret med 0,5% Triton, inkuberes i 10 minutter i det befugtede kammer. Overfør cellerne til en 30 mikroliter dråbe blokerende opløsning indeholdende sekundære antistoffer såsom anti-human 633 og anti-kanin 568.
Og inkuber i en time ved stuetemperatur. For at montere cellerne på mikroskopobjektglasset skal du overføre cellerne til en 10 mikroliter dråbe monteringsmedie, der indeholder DAPI. Tilsæt små prikker vaselin til hvert hjørne af dækslet.
Placer dem forsigtigt oven på monteringsmediedråben, og tryk langsomt for at fordele. Forsegl dækslet til glideren ved hjælp af klar neglelak. Billede kinetochores ved hjælp af et konfokalmikroskop udstyret med et 40 eller 63 X mål.
Og ved hjælp af anticentromer-antistofsignalet bestemmes Z-området, der tillader billeddannelse af hele kromosomområdet. De DMSO-behandlede kontroloocytter ekstruderede et polært legeme omkring 14 timer efter frigivelse fra milrinon. Efter SAC-aktivering blev nocodazolbehandlede oocytter arresteret i metafase et og ekstruderede ikke et polært legeme.
I mangel af SAC-aktivering ekstruderede oocytter imidlertid et polært legeme på trods af at de ikke havde nogen kinetochore-mikrotubulære vedhæftede filer. Hastigheden af sekurin-gfp nedbrydning under myotisk modning blev evalueret. Med dette kontrol-DMSO-behandlede oocytter begynder securin-gfp-intensiteten at falde ca. 10 timer efter milrinonudvaskning.
Når oocytter blev modnet i nærvær af SAC-aktiveringsmidlet, nocodazol, var securin-gfp-niveauerne stabile i hele perioden med myotisk modning. I modsætning hertil, når man forhindrede SAC-aktivering med reversinbehandling, accelererede securin-gfp-mønsteret, og nedbrydning begyndte cirka fire timer efter milrinonudvaskning i overensstemmelse med SAC-hæmning. Konfokal billeddannelse blev anvendt til at detektere centromerer og MAD2 af oocytter modnet til tidlig prometafase et, sen prometafase et og metafase et.
For at evaluere styrken af SAC-signalet blev kinetochore lokaliseret, MAD2 pixelintensitet kvantificeret. Betydelige niveauer af MAD2-rekruttering til kinetochores forekommer i tidlig prometafase et, når de fleste kinetochores ikke var knyttet til mikrotubuli. Niveauerne af MAD2 faldt i senere prometafase og var næsten fraværende i metafase et, da alle kinetochores var stabilt bundet til mikrotubuli.
Det er vigtigt at fremhæve, at hver af disse teknikker har deres begrænsninger og deres fortolkning. Og vi foreslår at udføre en kombination af disse metoder til evaluering af SAC-integriteten. Disse tre essays giver forskere mulighed for at evaluere sækkens strenghed i oocytter, hvilket giver indsigt i en potentiel årsag til aneuploidier i humane æg.
Fejl i kromosomadskillelse er et almindeligt træk ved oocytter. Derfor giver undersøgelse af spindelsamlingskontrolpunktet vigtige spor om de mekanismer, der er nødvendige for at producere sunde æg. Denne protokol beskriver tre komplementære assays til evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved