Name: modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

אנו מודים לג'ני גרינגר ריצ'רדס על עבודתה היסודית באימות נושאי הבקרה שלנו, שמהם יצרנו את ה- iPSCs של הבקרה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32 MH019113 (ל- D.A.M. ו- K.A.K.), קרן נלי בול (ל- T.H.W. ו- A.J.W.), NIH R01 MH111578 (ל- V.A.M. ו- J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (ל- A.J.W.), וקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר (ל- V.A.M., J.A.W. ו- A.J.W.). הדמויות נוצרו עם BioRender.com.

המחקר בבני אדם אושר תחת אישור מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת איווה מספר 201805995 ואישור ועדת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים של אוניברסיטת איווה מספר 2017-02. ביופסיות עור התקבלו מהנבדקים לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב. הפיברובלסטים גודלו בתרבית ב-DMEM עם 15% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת חומצות אמינו לא...

<ol>
	<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).</li><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li><li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer.">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification.">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).</li><li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids.">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959 (2021).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li><li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells.">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li><li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a,+a+bHLH+transcriptional+gene,+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum.">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li><li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin.">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li><li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Class+III+&#946;-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture.">Expression of the Class III &#946;-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li><li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes.">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li><li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor,+Corl2,+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker.">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li><li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development.">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li><li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development.">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18.">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li><li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li><li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia.">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li><li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia:+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept.">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li><li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia.">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li><li>Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation.">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li><li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons.">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li><li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development.">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li><li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum.">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum.">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).</li></ol>

היכולת למדל את התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה חשובה למידול מחלות, כמו גם לקידום ההבנה של התפתחות מוחית תקינה. פרוטוקולים פחות מסובכים וחסכוניים יוצרים יותר הזדמנויות ליצירת נתונים הניתנים לשכפול וליישום נרחב במעבדות מדעיות מרובות. פרוטוקול הבחנה של המוח הקטן מתואר כאן באמצעות שיט?...

הבנת התפתחות המוח הקטן האנושי וחלונות הזמן הקריטיים של תהליך זה חשובה לא רק לפענוח הגורמים האפשריים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אלא גם לזיהוי מטרות חדשות להתערבות טיפולית. מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה היה מאתגר, אך עם הזמן, פרוטוקולים רבים המבדילים בין תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או iPSCs עם גורלות שושלת המוח הקטן התגלו 1,2,3,4,5,6,7,8 . יתר על כן, חשוב לפתח פרוטוקולים המניבים תוצאות הניתנות לשחזור, הם פשוטים יחסית (כדי להפחית טעויות), ואינם כבדים בעלויות כספיות.
הפרוטוקולים הראשונים להתמיינות המוח הקטן נוצרו מתרביות דו-ממדיות מגופים עובריים מצופים (EBs), מה שגרם לגורל המוח הקטן עם גורמי גדילה שונים הדומים להתפתחות in vivo, כולל WNT, BMPs ו-FGFs 1,9. פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה גרמו להבחנה בעיקר בתרבית אורגנואידית תלת-ממדית עם FGF2 ואינסולין, ולאחר מכן FGF19 ו-SDF1 עבור מבנים דמויי שפתיים רומביים3,4, או השתמשו בשילוב של FGF2, FGF4 ו-FGF85. שתי שיטות האינדוקציה האורגנואידית של המוח הקטן הביאו לאורגנואידים תלת-ממדיים דומים של המוח הקטן, שכן שני הפרוטוקולים דיווחו על ביטוי דומה של סמן המוח הקטן בנקודות זמן זהות. הולמס והיינה הרחיבו את פרוטוקול 5 התלת-ממדישלהם כדי להראות שתאי המוח הקטן הדו-ממדיים יכולים להיווצר מתאי גזע עובריים ו-iPSCs, שמתחילים כאגרגטים תלת-ממדיים. בנוסף, Silva et al.7 הראו כי תאים המייצגים נוירונים בוגרים במוח הקטן בדו-ממד יכולים להיווצר בגישה דומה להולמס והיינה, תוך שימוש בנקודת זמן שונה למעבר מתלת-ממד לדו-ממד ולהארכת זמן הגדילה וההתבגרות.
הפרוטוקול הנוכחי גורם לגורל המוח הקטן ב-iPSCs נטולי הזנה על ידי יצירת גופים עובריים צפים חופשיים (EBs) באמצעות אינסולין ו-FGF2 ולאחר מכן ציפוי ה-EBs על כלים מצופים אש"ף/למינין ביום ה-14 לגדילה והתמיינות דו-ממדית. עד יום 35, תאים עם זהות cerebellar מתקבלים. היכולת לשחזר את השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן, במיוחד בסביבה דו-ממדית, מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות ספציפיות הדורשות ניסויים עם מבנה חד-שכבתי. פרוטוקול זה מקובל גם על שינויים נוספים כגון משטחים מיקרו-מפוסלים, מבחני צמיחה אקסונאליים ומיון תאים כדי להעשיר את אוכלוסיות התאים הרצויות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-thio-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filter Unit, 0.2 &#181;m aPES, 50 mm Dia</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>276885</td>
			<td>Nucleofector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well ultra-low attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroman 1</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>34681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2, Biological safety Cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-540-600</td>
			<td>Hood, UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethly sulfoxide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS+/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emricasan</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>22204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi5 episomal iPSC reprogramming kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8-Flex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>PSC medium with heat-stable FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanine-L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Anti-EN2, mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-293311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-Ki67/MKI67, rabbit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB7617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-PTF1a, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-98726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-TUBB3, mouse</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>C1310</td>
			<td>Benchtop mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &#181;g)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2040</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2010</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamine supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See through self-sealable pouches</td>
			<td>Steriking</td>
			<td>SS-T2 (90x250)</td>
			<td>Autoclave pouches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, sterile, PES 0.22 &#181;m, 30 mm Dia</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>256131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-ISRIB</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Phenol and guanidine isothiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor pressure osmometer</td>
			<td>Wescor, Inc.</td>
			<td>Model 5520</td>
			<td>Osmometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Biogems</td>
			<td>1293823</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure

ההתפתחות המדויקת והמתוזמנת של המוח הקטן חיונית לא רק לתיאום ואיזון מוטורי מדויקים אלא גם לקוגניציה. בנוסף, הפרעה בהתפתחות המוח הקטן מעורבת בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות, כולל אוטיזם, הפרעת קשב וריכוז (ADHD) וסכיזופרניה. חקירות של התפתחות המוח הקטן בבני אדם התאפשרו בעבר רק באמצעות מחקרים שלאחר המוות או הדמיה מוחית, אך שיטות אלה אינן מספיקות להבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ב- vivo במהלך ההתפתחות המוקדמת, כאשר נוצרות הפרעות נוירו-התפתחותיות רבות. הופעתן של טכניקות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם מתאים סומטיים והיכולת להתמיין מחדש עוד יותר תאי גזע פלוריפוטנטיים לנוירונים סללו את הדרך למודלים חוץ-גופיים של התפתחות מוחית מוקדמת. המחקר הנוכחי מספק צעדים פשוטים לקראת יצירת תאים cerebellar עבור יישומים הדורשים מבנה חד-שכבתי דו-ממדי (2D). תאי Cerebellar המייצגים שלבי התפתחות מוקדמים נגזרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים באמצעות השלבים הבאים: ראשית, גופים עובריים מיוצרים בתרבית תלת-ממדית (3D), לאחר מכן הם מטופלים ב-FGF2 ובאינסולין כדי לקדם את מפרט הגורל של המוח הקטן, ולבסוף, הם מובחנים באופן סופי כמונו-שכבה על מצעים מצופים פולי-l-אורניתין (אש"ף)/למינין. לאחר 35 ימים של התמיינות, תרביות תאים צרבלריים שמקורם ב-iPSC מבטאות סמנים של המוח הקטן, כולל ATOH1, PTF1α, PAX6 ו-KIRREL2, מה שמרמז על כך שפרוטוקול זה יוצר מבשרי תאי צרבלר גלוטמטרגיים ו-GABAergic cerebellar, כמו גם אבות של תאי Purkinje. יתר על כן, התאים הממוינים מראים מורפולוגיה עצבית מובהקת והם חיוביים לסמנים אימונופלואורסצנטיים של זהות עצבית כגון TUBB3. תאים אלה מבטאים מולקולות הנחיה אקסונאליות, כולל סמפורין-4C, פלקסין-B2 ונוירופילין-1, ויכולים לשמש מודל לחקר המנגנונים המולקולריים של צמיחת נויריט וקישוריות סינפטית. שיטה זו יוצרת נוירונים במוח הקטן האנושי שימושיים עבור יישומים במורד הזרם, כולל ביטוי גנים, מחקרים פיזיולוגיים ומורפולוגיים הדורשים פורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים.

סקירה כללית של ההבחנה בין המוח הקטן מתלת-ממד לדו-ממד תאים Cerebellar נוצרים החל מ- iPSCs. איור 1A מציג את זרימת העבודה הכוללת ואת התוספת של רכיבים עיקריים לבידול. ביום 0, EBs מיוצרים על-ידי הרמה עדינה של מושבות iPSC (איור 1B) באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה ב-CDM המכיל?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

הפרוטוקול הנוכחי מסביר את יצירתו של מונולאייר דו-ממדי של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקר השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן.

מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

שיטה זו יכולה לסייע בחקר ההתפתחות המוחית האנושית המוקדמת וכיצד היא עשויה להשתנות בהפרעות נוירופסיכיאטריות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יצירת תאי המוח הקטן האנושיים המוקדמים מבחינה התפתחותית במבנה שכבה דו-ממדי מבלי לבצע שלבים מסובכים. זה גם חסכוני.הכנת פיפטות משיכה יכולה להיות מסובכת בהתחלה, אך עם תרגול וזמן, קל יותר למשוך את הפיפטות באופן שיהיה קל יותר לעבוד איתו. התחילו את ההכנה הניסיונית על ידי משיכת פיפטה פסטר באורך 22.9 ס"מ כשני סנטימטרים מתחת לצוואר, מעל מבער הבונזן כדי ליצור שתי פיפטות זכוכית. הצד הדק יותר יהיה קצר בכארבעה סנטימטרים מהצד השני.כופפו את קצות הצד המשוך על הלהבה כדי ליצור R חלק, ואז הניחו את הפיפטות הנמשכות בשרוולים של אוטוקלאב ועקרו אותן באוטוקלאב. ביום אפס, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו- SB-431542 לכל באר של שש בארות חיבור אולטרה-נמוך, או ULA, צלחת, והניחו אותו באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות. נקו את התאים הממוינים באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה.שאפו את המדיום והוסיפו מילימטר אחד של תמיסת מעבר iPSC עבור כל צלחת של 35 מילימטר. לאחר שלוש דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום והוסיפו שני מילימטרים של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו-SB-431542 תחת הגדלה 4x של מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטה הזכוכית הנמשכת. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כל המושבות לבאר אחת מתוך צלחת ULA בעלת שש הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC ודגירה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני, הוסיפו FGF2 לכל באר כדי להתאים ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר. ביום השביעי, לשנות שליש מהמדיום על ידי שאיפה מיליליטר אחד של בינוני בילה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום הבחנה cerebellar טרי.לדגור על גופות העוברים במשך שבעה ימים. ביום ה-14, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל גופי העובר במרכז הצלחת. לאחר מכן הטה את הצלחת ושאף את כל המדיום בילה באמצעות פייפטר 1000 microliter מהקצה.ככל שהכמות הבינונית פוחתת, לאט לאט מניחים את הצלחת שטוחה וממשיכים לשאוף, משאירים מספיק בינוני כדי להימנע מלמשוך את גופי העובר החוצה. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום הבחנה cerebellar טרי בתוספת 10 micromolar Y-27632. לאחר מכן מעבירים את גופי העובר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר לצלחת מצופה פולי-L-אורניתין למינין.ביום 15, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום הבחנה cerebellar טרי. ביום האפס, מושבות iPSC נוקו והוסרו למדיום התמיינות המוח הקטן המכיל SB-431542 ו- Y-27632 והוכנסו ללוחות חיבור נמוכים במיוחד ליצירת גופים עובריים. התוספת של FGF2 ביום השני ושינוי של 1/3 מדיום ביום השביעי הביאו לכך שגופים עובריים הראו הגדלה ביום ה-14.תאים החלו לנדוד החוצה מגופי העובר לאורך המשטח המצופה ביום ה-15. השינוי המוחלט של מדיום ההבשלה של המדיום לתווך המוח הקטן מהיום ה-21 הביא לחד-שכבתי של תאים עם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומורכבות עד היום ה-35. ניתוח ביטוי הגנים ביום ה-35 גילה כי התאים מבטאים סמני אב מוקדמים של המוח הקטן כגון אבות גלוטמטרגיים, ATOH1, אבות GABAergic, אלפא PTF1, וסמני תאי האב של Purkinje KIRREL2 ו-SKOR2.בנוסף, נצפו גם הביטוי של סמן שפתיים רומבי OTX2 ובעיקר נוירון קדמי ספציפי SIX3. התיוג האימונופלואורסצנטי של התאים שנקטפו ביום ה-35 הראה כתמים חיוביים עבור סמני המוח הקטן EN2 ו-PTF1 אלפא, הסמן העצבי בטא טובולין III וסמן ההתרבות KI67. צביעה גרעינית עם 4'6-דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, הראתה גרעיני תאים.כדי לקבל בידול מוצלח, חשוב להתחיל עם מושבות iPSC בריאות ולא מובחנות ולהשתמש בריאגנטים ששוחזרו מחדש ככל האפשר.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior. These 'self-administration' methods have been used extensively in drug addiction research due to their high construct validity. Operant studies provide researchers a tool for preclinical investigation of several aspects of the addiction process. For example, mechanisms of acute reinforcement (both drug and non-drug) can be tested using pharmacological or genetic tools to determine the ability of a molecular target to influence self-administration behavior1-6. Additionally, drug or food seeking behaviors can be studied in the absence of the primary reinforcer, and the ability of pharmacological compounds to disrupt this process is a preclinical model for discovery of molecular targets and compounds that may be useful for the treatment of addiction3,7-9. One problem with performing intravenous drug self-administration studies in the mouse is the technical difficulty of maintaining catheter patency. Attrition rates in these experiments are high and can reach 40% or higher10-15. Another general problem with drug self-administration is discerning which pharmacologically-induced effects of the reinforcer produce specific behaviors. For example, measurement of the reinforcing and neurological effects of psychostimulants can be confounded by their psychomotor effects. Operant methods using food reinforcement can avoid these pitfalls, although their utility in studying drug addiction is limited by the fact that some manipulations that alter drug self-administration have a minimal impact on food self-administration. For example, mesolimbic dopamine lesion or knockout of the D1 dopamine receptor reduce cocaine self-administration without having a significant impact on food self-administration 12,16. 
Sensory stimuli have been described for their ability to support operant responding as primary reinforcers (i.e. not conditioned reinforcers)17-22. Auditory and visual stimuli are self-administered by several species18,21,23, although surprisingly little is known about the neural mechanisms underlying this reinforcement. The operant sensation seeking (OSS) model is a robust model for obtaining sensory self-administration in the mouse, allowing the study of neural mechanisms important in sensory reinforcement24. An additional advantage of OSS is the ability to screen mutant mice for differences in operant behavior that may be relevant to addiction. We have reported that dopamine D1 receptor knockout mice, previously shown to be deficient in psychostimulant self-administration, also fail to acquire OSS24. This is a unique finding in that these mice are capable of learning an operant task when food is used as a reinforcer. While operant studies using food reinforcement can be useful in the study of general motivated behavior and the mechanisms underlying food reinforcement, as mentioned above, these studies are limited in their application to studying molecular mechanisms of drug addiction. Thus, there may be similar neural substrates mediating sensory and psychostimulant reinforcement that are distinct from food reinforcement, which would make OSS a particularly attractive model for the study of drug addiction processes. The degree of overlap between other molecular targets of OSS and drug reinforcers is unclear, but is a topic that we are currently pursuing. While some aspects of addiction such as resistance to extinction may be observed with OSS, we have found that escalation 25 is not observed in this model24. Interestingly, escalation of intake and some other aspects of addiction are observed with self-administration of sucrose26. Thus, when non-drug operant procedures are desired to study addiction-related processes, food or sensory reinforcers can be chosen to best fit the particular question being asked. 
In conclusion, both food self-administration and OSS in the mouse have the advantage of not requiring an intravenous catheter, which allows a higher throughput means to study the effects of pharmacological or genetic manipulation of neural targets involved in motivation. While operant testing using food as a reinforcer is particularly useful in the study of the regulation of food intake, OSS is particularly apt for studying reinforcement mechanisms of sensory stimuli and may have broad applicability to novelty seeking and addiction.

In this protocol we describe a method of operant learning using sensory stimuli as a reinforcer in the mouse. It requires no prior training or food restriction, and it allows the study of motivated behavior without the use of a pharmacological or natural reinforcer such as food.

Sensation Seeking אופרנטית ב העכבר

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options. We seek to define how neural immune signaling modulates the susceptibility to migraine, modeled in vitro using spreading depression (SD), as a means to develop novel therapeutic targets for episodic and chronic migraine. SD is the likely cause of migraine aura and migraine pain. It is a paroxysmal loss of neuronal function triggered by initially increased neuronal activity, which slowly propagates within susceptible brain regions. Normal brain function is exquisitely sensitive to, and relies on, coincident low-level immune signaling. Thus, neural immune signaling likely affects electrical activity of SD, and therefore migraine. Pain perception studies of SD in whole animals are fraught with difficulties, but whole animals are well suited to examine systems biology aspects of migraine since SD activates trigeminal nociceptive pathways. However, whole animal studies alone cannot be used to decipher the cellular and neural circuit mechanisms of SD. Instead, in vitro preparations where environmental conditions can be controlled are necessary. Here, it is important to recognize limitations of acute slices and distinct advantages of hippocampal slice cultures. Acute brain slices cannot reveal subtle changes in immune signaling since preparing the slices alone triggers: pro-inflammatory changes that last days, epileptiform behavior due to high levels of oxygen tension needed to vitalize the slices, and irreversible cell injury at anoxic slice centers. 
In contrast, we examine immune signaling in mature hippocampal slice cultures since the cultures closely parallel their in vivo counterpart with mature trisynaptic function; show quiescent astrocytes, microglia, and cytokine levels; and SD is easily induced in an unanesthetized preparation. Furthermore, the slices are long-lived and SD can be induced on consecutive days without injury, making this preparation the sole means to-date capable of modeling the neuroimmune consequences of chronic SD, and thus perhaps chronic migraine. We use electrophysiological techniques and non-invasive imaging to measure neuronal cell and circuit functions coincident with SD. Neural immune gene expression variables are measured with qPCR screening, qPCR arrays, and, importantly, use of cDNA preamplification for detection of ultra-low level targets such as interferon-gamma using whole, regional, or specific cell enhanced (via laser dissection microscopy) sampling. Cytokine cascade signaling is further assessed with multiplexed phosphoprotein related targets with gene expression and phosphoprotein changes confirmed via cell-specific immunostaining. Pharmacological and siRNA strategies are used to mimic and modulate SD immune signaling.

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Migraine and its transformation to chronic migraine are immense healthcare burdens in need of improved treatment options. We seek to define how neural immune signaling modulates the susceptibility to migraine, modeled in vitro using spreading depression in hippocampal slice cultures, as a means to develop novel therapeutic targets.

דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...