Name: modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

Мы благодарим Дженни Грингер Ричардс за ее тщательную работу по проверке наших контрольных субъектов, из которых мы создали контрольные iPSC. Эта работа была поддержана NIH T32 MH019113 (D.A.M. и K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. и A.J.W.), NIH R01 MH111578 (V.A.M. и J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.) и Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. и A.J.W.). Фигуры создавались с BioRender.com.

Исследование на людях было одобрено в соответствии с номером одобрения Совета по институциональному обзору Университета Айовы 201805995 и номером одобрения Комитета по плюрипотентным стволовым клеткам человека Университета Айовы 2017-02. Биопсия кожи была получена от испытуемых после полу?...

<ol>
	<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).</li><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li><li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer.">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification.">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).</li><li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids.">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959 (2021).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li><li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells.">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li><li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a,+a+bHLH+transcriptional+gene,+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum.">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li><li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin.">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li><li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Class+III+&#946;-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture.">Expression of the Class III &#946;-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li><li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes.">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li><li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor,+Corl2,+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker.">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li><li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development.">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li><li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development.">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18.">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li><li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li><li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia.">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li><li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia:+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept.">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li><li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia.">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li><li>Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation.">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li><li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons.">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li><li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development.">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li><li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum.">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum.">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).</li></ol>

Способность моделировать развитие мозжечка человека in vitro важна для моделирования заболеваний, а также для дальнейшего понимания нормального развития мозга. Менее сложные и экономичные протоколы создают больше возможностей для генерации реплицируемых данных и широкого внедрен?...

Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии, 1,2,3,4,5,6,7,8 . Кроме того, важно разработать протоколы, которые генерируют воспроизводимые результаты, относительно просты (для уменьшения ошибок) и не являются тяжелыми для денежных затрат.
Первые протоколы дифференцировки мозжечка были сгенерированы из 2D-культур из покрытых эмбриоидных тел (ЭБ), вызывая судьбу мозжечка с различными факторами роста, аналогичными развитию in vivo, включая WNT, BMP и FGF 1,9. Более поздние опубликованные протоколы индуцировали дифференцировку в основном в 3D органоидной культуре с FGF2 и инсулином, за которыми следовали FGF19 и SDF1 для ромбических губоподобных структур 3,4, или использовали комбинацию FGF2, FGF4 и FGF85. Оба метода индукции мозжечковых органоидов привели к получению аналогичных 3D-органоидов мозжечка, поскольку оба протокола сообщали о сходной экспрессии мозжечковых маркеров в одинаковые моменты времени. Холмс и Гейне расширили свой 3D-протокол5, чтобы показать, что 2D-мозжечковые клетки могут быть сгенерированы из hESCs и iPSCs, которые начинаются как 3D-агрегаты. Кроме того, Silva et al.7 продемонстрировали, что клетки, представляющие зрелые мозжечковые нейроны в 2D, могут быть сгенерированы с помощью аналогичного подхода Холмса и Гейне, используя другую точку времени для переключения с 3D на 2D и продления времени роста и созревания.
Текущий протокол индуцирует мозжечковую судьбу в IPSC без кормушек путем генерации свободно плавающих эмбриональных тел (ЭБ) с использованием инсулина и FGF2, а затем покрытия ЭБ на посуде с покрытием PLO / ламинином на 14-й день для 2D-роста и дифференцировки. К 35 дню получают клетки с мозжечковой идентичностью. Способность повторять ранние стадии развития мозжечка, особенно в 2D-среде, позволяет исследователям отвечать на конкретные вопросы, требующие экспериментов с однослойной структурой. Этот протокол также поддается дальнейшим модификациям, таким как микроструктурированные поверхности, анализы аксонального роста и сортировка клеток для обогащения желаемых клеточных популяций.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-thio-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filter Unit, 0.2 &#181;m aPES, 50 mm Dia</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>276885</td>
			<td>Nucleofector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well ultra-low attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroman 1</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>34681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2, Biological safety Cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-540-600</td>
			<td>Hood, UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethly sulfoxide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS+/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emricasan</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>22204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi5 episomal iPSC reprogramming kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8-Flex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>PSC medium with heat-stable FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanine-L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Anti-EN2, mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-293311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-Ki67/MKI67, rabbit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB7617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-PTF1a, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-98726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-TUBB3, mouse</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>C1310</td>
			<td>Benchtop mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &#181;g)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2040</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2010</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamine supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See through self-sealable pouches</td>
			<td>Steriking</td>
			<td>SS-T2 (90x250)</td>
			<td>Autoclave pouches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, sterile, PES 0.22 &#181;m, 30 mm Dia</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>256131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-ISRIB</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Phenol and guanidine isothiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor pressure osmometer</td>
			<td>Wescor, Inc.</td>
			<td>Model 5520</td>
			<td>Osmometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Biogems</td>
			<td>1293823</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure

Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.

Обзор дифференциации мозжечка от 3D до 2D Мозжечковые клетки генерируются начиная с иПСК. На рисунке 1А показан общий рабочий процесс и добавление основных компонентов для дифференциации. На 0-й день ЭБ производятся путем осторожного подъема колоний iPSC (<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.

Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Этот метод может помочь в изучении раннего развития мозжечка человека и того, как оно может быть изменено при нервно-психических расстройствах. Ключевым преимуществом этого метода является генерация ранних мозжечковых клеток человека в структуре 2D-слоя без выполнения сложных шагов. Это также экономически выгодно.Изготовление вытягивающих пипеток может быть сложным в начале, но с практикой и временем становится легче тянуть пипетки таким образом, чтобы с ними было легче работать. Начните экспериментальную подготовку, вытащив 22,9-сантиметровую пипетку Пастера примерно на два сантиметра ниже шеи, над горелкой Бунзена, чтобы создать две стеклянные пипетки. Более тонкая сторона будет примерно на четыре сантиметра короче другой.Согните кончики вытянутой стороны на пламени, чтобы создать гладкий R, затем поместите вытянутые пипетки в рукава автоклава и стерилизуйте их в автоклаве. На нулевой день добавьте один миллилитр мозжечковой дифференцировочной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632 и SB-431542, в каждую лунку шестилуночной сверхнизкой пластины крепления или ULA, и поместите ее в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в лунки. Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки.Аспирируйте среду и добавляйте один миллиметр раствора iPSC для каждого 35-миллиметрового блюда. После трех минут инкубации при 37 градусах Цельсия аспирировать среду и добавить два миллиметра мозжечковой дифференцированной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632 и SB-431542 Под 4-кратным увеличением перевернутого микроскопа пропускаемого света, поднимите колонии с помощью изогнутого края вытянутой стеклянной пипетки. Как только каждая колония будет поднята, аккуратно переложите все колонии в один колодец шестилуночной пластины ULA, используя серологическую пипетку объемом 10 миллилитров.Повторите этот процесс для каждой пластины iPSC и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. На второй день добавьте FGF2 в каждую скважину, чтобы отрегулировать конечную концентрацию 50 нанограммов на миллилитр. На седьмой день измените одну треть среды, аспирировав один миллилитр отработанной среды и заменив его одним миллилитром свежей мозжечковой дифференцировочной среды.Насиживайте эмбриоидные тела в течение семи дней. На 14-й день закрутите пластину, чтобы собрать все эмбриоидные тела в центре пластины. Затем наклоните пластину и аспирируйте всю отработанную среду с помощью пипетки 1000 микролитров от края.По мере уменьшения среднего количества медленно укладывайте пластину плоско и продолжайте аспирировать, оставляя достаточно среды, чтобы избежать вытягивания эмбриоидных тел. Далее добавляют три миллилитра свежей мозжечковой дифференцировочной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632. Затем перенесите эмбриоидные тела с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров в блюдо, покрытое поли-L-орнитином.На 15 день аспирируйте среду и замените ее свежей мозжечковой дифференцировочной средой. На нулевой день колонии iPSC очищали и поднимали в мозжечковую дифференцирующую среду, содержащую SB-431542 и Y-27632, и помещали в сверхнизкие пластины прикрепления для генерации эмбриональных тел. Добавление FGF2 на второй день и изменение среды на 1/3 на седьмой день привело к увеличению эмбриональных тел на 14-й день.Клетки начали мигрировать наружу из эмбриональных тел вдоль покрытой поверхности на 15-й день. Полное изменение среды на среду созревания мозжечка с 21-го дня привело к монослою клеток с нейроноподобной морфологией и сложностью к 35-му дню. Анализ экспрессии генов на 35-й день показал, что клетки экспрессируют ранние маркеры-предшественники мозжечка, такие как глутаматергические предшественники, ATOH1, ГАМКергические предшественники, PTF1 альфа и клеточные маркеры-предшественники Пуркинье KIRREL2 и SKOR2.Кроме того, также наблюдалась экспрессия ромбического губного маркера OTX2 и в основном переднего нейрон-специфического SIX3. Иммунофлуоресцентная маркировка клеток, собранных на 35-й день, показала положительное окрашивание для маркеров мозжечка EN2 и PTF1 альфа, нейронального маркера бета-тубулина III и маркера пролиферации KI67. Ядерное окрашивание 4'6-диамидино-2-фенилиндолом, или DAPI, показало клеточные ядра.Для успешной дифференциации крайне важно начать со здоровых и недифференцированных колоний iPSC и использовать реагенты, которые как можно только что восстановлены.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Оперантное Sensation ищу в мышь

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Моделирование нейронных иммунной сигнализации эпизодической и хронической мигрени Использование распространяющейся депрессии In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Лазерная нанохирургии мозжечка Аксоны<em&gt; В Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Моделирование Астроцитома Патогенез<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Экстракорпоральное моделирование раковой Neural вторжение: Спинной ганглий корень модели

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Моделирование болезнь Шарко Мари зуб в пробирке Transfecting мышь первичной мотонейронов

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...