Name: modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

Vi tackar Jenny Gringer Richards för hennes grundliga arbete med att validera våra kontrollpersoner, från vilka vi genererade kontroll-iPSC: erna. Detta arbete stöddes av NIH T32 MH019113 (till D.A.M. och K.A.K.), Nellie Ball Trust (till T.H.W. och A.J.W.), NIH R01 MH111578 (till V.A.M. och J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (till A.J.W.) och Roy J. Carver Charitable Trust (till V.A.M., J.A.W. och A.J.W.). Figurerna skapades med BioRender.com.

Forskningen på människor godkändes under University of Iowa Institutional Review Board godkännandenummer 201805995 och University of Iowa Human Pluripotent Stem Cell Committee godkännandenummer 2017-02. Hudbiopsier erhölls från försökspersonerna efter att ha fått skriftligt informerat samtycke. Fibroblasterna odlades i DMEM med 15% fetalt bovint serum (FBS) och 1% MEM-icke-essentiell aminosyralösning vid 37 ° C och 5%CO2. Fibroblaster omprogrammerades med hjälp av ett episomalt omprogrammeringssat...

<ol>
	<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).</li><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li><li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer.">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification.">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).</li><li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids.">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959 (2021).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li><li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells.">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li><li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a,+a+bHLH+transcriptional+gene,+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum.">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li><li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin.">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li><li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Class+III+&#946;-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture.">Expression of the Class III &#946;-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li><li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes.">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li><li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor,+Corl2,+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker.">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li><li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development.">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li><li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development.">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18.">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li><li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li><li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia.">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li><li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia:+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept.">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li><li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia.">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li><li>Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation.">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li><li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons.">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li><li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development.">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li><li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum.">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum.">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).</li></ol>

Förmågan att modellera human cerebellär utveckling in vitro är viktig för sjukdomsmodellering samt för att främja förståelsen för normal hjärnutveckling. Mindre komplicerade och kostnadseffektiva protokoll skapar fler möjligheter för replikerbar datagenerering och bred implementering över flera vetenskapliga laboratorier. Ett cerebellärt differentieringsprotokoll beskrivs här med hjälp av en modifierad metod för att generera EBs som inte kräver enzymer eller dissociationsmedel, med hjälp av t...

Att förstå mänsklig cerebellär utveckling och de kritiska tidsfönstren i denna process är viktigt inte bara för att avkoda de möjliga orsakerna till neurodevelopmental störningar utan också för att identifiera nya mål för terapeutisk intervention. Modellering av mänsklig cerebellär utveckling in vitro har varit utmanande, men med tiden har många protokoll som skiljer mänskliga embryonala stamceller (hESC) eller iPSC med cerebellär härstamning öden uppstått 1,2,3,4,5,6,7,8 . Dessutom är det viktigt att utveckla protokoll som genererar reproducerbara resultat, är relativt enkla (för att minska fel) och inte är tunga på monetära kostnader.
De första protokollen för cerebellär differentiering genererades från 2D-kulturer från pläterade embryoidkroppar (EBs), vilket inducerade cerebellärt öde med olika tillväxtfaktorer som liknar in vivo-utveckling, inklusive WNT, BMP och FGF 1,9. Nyare publicerade protokoll inducerade differentiering främst i 3D-organoidkultur med FGF2 och insulin, följt av FGF19 och SDF1 för rombiska läppliknande strukturer3,4, eller använde en kombination av FGF2, FGF4 och FGF85. Båda cerebellära organoidinduktionsmetoderna resulterade i liknande 3D-cerebellära organoider eftersom båda protokollen rapporterade liknande cerebellärt marköruttryck vid identiska tidpunkter. Holmes och Heine utökade sitt 3D-protokoll5 för att visa att 2D-cerebellära celler kan genereras från hESC och iPSC, som börjar som 3D-aggregat. Dessutom visade Silva et al.7 att celler som representerar mogna cerebellära neuroner i 2D kan genereras med ett liknande tillvägagångssätt som Holmes och Heine, med hjälp av en annan tidpunkt för att byta från 3D till 2D och förlänga tiden för tillväxt och mognad.
Det nuvarande protokollet inducerar cerebellärt öde i matarfria iPSC genom att generera fritt flytande embryoidkroppar (EB) med insulin och FGF2 och sedan plätera EBs på PLO / lamininbelagda rätter på dag 14 för 2D-tillväxt och differentiering. Vid dag 35 erhålls celler med cerebellär identitet. Förmågan att rekapitulera de tidiga stadierna av cerebellär utveckling, särskilt i en 2D-miljö, gör det möjligt för forskare att svara på specifika frågor som kräver experiment med en monolagerstruktur. Detta protokoll är också mottagligt för ytterligare modifieringar såsom mikromönstrade ytor, axonala utväxtanalyser och cellsortering för att berika de önskade cellpopulationerna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-thio-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-26B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filter Unit, 0.2 &#181;m aPES, 50 mm Dia</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>276885</td>
			<td>Nucleofector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well ultra-low attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30529.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroman 1</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>34681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II, Type A2, Biological safety Cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-540-600</td>
			<td>Hood, UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well plate, TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethly sulfoxide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS+/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emricasan</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>22204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi5 episomal iPSC reprogramming kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8-Flex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>PSC medium with heat-stable FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanine-L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Anti-EN2, mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-293311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-Ki67/MKI67, rabbit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB7617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-PTF1a, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-98726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-TUBB3, mouse</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>C1310</td>
			<td>Benchtop mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &#181;g)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2040</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T2010</td>
			<td>Silica spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamine supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See through self-sealable pouches</td>
			<td>Steriking</td>
			<td>SS-T2 (90x250)</td>
			<td>Autoclave pouches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, sterile, PES 0.22 &#181;m, 30 mm Dia</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>256131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-ISRIB</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Phenol and guanidine isothiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor pressure osmometer</td>
			<td>Wescor, Inc.</td>
			<td>Model 5520</td>
			<td>Osmometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Biogems</td>
			<td>1293823</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling human cerebellar development in vitro in 2d structure

Den exakta och snabba utvecklingen av lillhjärnan är avgörande inte bara för exakt motorisk koordination och balans utan också för kognition. Dessutom har störningar i cerebellär utveckling varit inblandade i många neurodevelopmental störningar, inklusive autism, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) och schizofreni. Undersökningar av cerebellär utveckling hos människor har tidigare endast varit möjliga genom obduktionsstudier eller neuroimaging, men dessa metoder är inte tillräckliga för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som sker in vivo under tidig utveckling, vilket är när många neuroutvecklingsstörningar uppträder. Framväxten av tekniker för att generera humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) från somatiska celler och förmågan att ytterligare omdifferentiera iPSC till nervceller har banat väg för in vitro-modellering av tidig hjärnutveckling. Denna studie ger förenklade steg mot att generera cerebellära celler för applikationer som kräver en 2-dimensionell (2D) monolagerstruktur. Cerebellära celler som representerar tidiga utvecklingsstadier härrör från humana iPSC via följande steg: först tillverkas embryoidkroppar i 3-dimensionell (3D) kultur, sedan behandlas de med FGF2 och insulin för att främja cerebellär ödespecifikation, och slutligen differentieras de terminalt som ett monolager på poly-l-ornitin (PLO) / lamininbelagda substrat. Vid 35 dagars differentiering uttrycker iPSC-härledda cerebellära cellkulturer cerebellära markörer inklusive ATOH1, PTF1α, PAX6 och KIRREL2, vilket tyder på att detta protokoll genererar glutamaterga och GABAerga cerebellära neuronala prekursorer, liksom Purkinje-cellförfäder. Dessutom visar de differentierade cellerna distinkt neuronal morfologi och är positiva för immunofluorescensmarkörer för neuronal identitet såsom TUBB3. Dessa celler uttrycker axonala vägledningsmolekyler, inklusive semaphorin-4C, plexin-B2 och neuropilin-1, och kan fungera som en modell för att undersöka de molekylära mekanismerna för neuritutväxt och synaptisk anslutning. Denna metod genererar mänskliga cerebellära neuroner som är användbara för nedströmsapplikationer, inklusive genuttryck, fysiologiska och morfologiska studier som kräver 2D-monolagerformat.

Översikt över 3D till 2D cerebellär differentiering Cerebellära celler genereras från iPSC. Figur 1A visar det övergripande arbetsflödet och tillägget av huvudkomponenter för differentiering. På dag 0 tillverkas EBs genom att försiktigt lyfta iPSC-kolonierna (figur 1B) med hjälp av en dragen glaspipett i CDM innehållande SB431542 och Y-27632 och placeras i ultralåga fästplattor. FGF2 läggs till dag 2. På dag 7 ändras en tred...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure at JoVE.com

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Detta protokoll förklarar genereringen av ett 2D-monolager av cerebellära celler från inducerade pluripotenta stamceller för att undersöka de tidiga stadierna av cerebellär utveckling.

Modellering av mänsklig cerebellär utveckling in vitro i 2D-struktur

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Denna metod kan hjälpa till att studera tidig mänsklig cerebellär utveckling och hur den kan förändras vid neuropsykiatriska störningar. Den viktigaste fördelen med denna metod är att generera utvecklingsmässigt tidiga mänskliga cerebellära celler i en 2D-skiktstruktur utan att utföra komplicerade steg. Det är också kostnadseffektivt.Att göra dragpipetter kan vara knepigt i början, men med övning och tid blir det lättare att dra pipetterna på ett sätt som blir lättare att arbeta med. Börja den experimentella beredningen genom att dra en 22,9 centimeter Pasteur-pipett ungefär två centimeter under halsen, ovanför bunsenbrännaren för att skapa två glaspipetter. Den tunnare sidan blir ungefär fyra centimeter kortare än den andra.Böj spetsarna på den dragna sidan på lågan för att skapa en slät R, placera sedan de dragna pipetterna i autoklavhylsor och sterilisera dem i en autoklav. På dag noll, tillsätt en milliliter cerebellär differentieringsmedium kompletterat med 10 mikromolära Y-27632 och SB-431542 till varje brunn av en sex-brunn ultralåg fastsättning, eller ULA, platta, och placera den i inkubatorn tills de lyfta kolonierna är redo att läggas till brunnarna. Rengör de differentierade cellerna med en dragen glaspipett.Aspirera mediet och tillsätt en millimeter iPSC-passeringslösning för varje 35 millimeters skål. Efter tre minuters inkubation vid 37 grader Celsius, aspirera mediet och tillsätt två millimeter cerebellärt differentieringsmedium kompletterat med 10 mikromolära Y-27632 och SB-431542 Under 4x förstoring av ett inverterat ljusmikroskop, lyft kolonierna med den böjda kanten på den dragna glaspipetten. När varje koloni har lyfts, överför försiktigt alla kolonier till en brunn på ULA-plattan med sex brunnar med en 10 ml serologisk pipett.Upprepa denna process för varje iPSC-platta och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. På dag två, tillsätt FGF2 till varje brunn för att justera en slutlig koncentration på 50 nanogram per milliliter. På dag sju, byt en tredjedel av mediet genom att aspirera en milliliter använt medium och ersätta det med en milliliter färskt cerebellärt differentieringsmedium.Inkubera embryoidkropparna i sju dagar. På dag 14, virvla plattan för att samla alla embryoidkroppar i mitten av plattan. Luta sedan plattan och aspirera allt använt medium med en 1000 mikroliter pipetter från kanten.När medelmängden minskar, lägg långsamt plattan platt och fortsätt att aspirera, vilket ger tillräckligt med medium för att undvika att dra ut embryoidkropparna. Tillsätt sedan tre milliliter färskt cerebellärt differentieringsmedium kompletterat med 10 mikromolära Y-27632. Överför sedan embryoidkropparna med en 10 ml serologisk pipett till en Poly-L-Ornithine Laminin-belagd skål.På dag 15, aspirera mediet och ersätt det med färskt cerebellärt differentieringsmedium. På dag noll rengjordes iPSC-kolonier och lyftes till cerebellärt differentieringsmedium innehållande SB-431542 och Y-27632 och placerades i ultralåga fästplattor för att generera embryoidkroppar. Tillsatsen av FGF2 på dag två och en förändring av 1/3 medium på dag sju resulterade i att embryoidkroppar visade förstoring den 14: e dagen.Celler började migrera utåt från embryoidkropparna längs den belagda ytan den 15: e dagen. Den fullständiga förändringen av mediet till cerebellärt mognadsmedium från den 21: a dagen resulterade i ett monolager av celler med neuronalliknande morfologi och komplexitet vid den 35: e dagen. Genuttrycksanalysen vid dag 35 avslöjade att cellerna uttrycker tidiga cerebellära stamfadermarkörer såsom glutamaterga stamfäder, ATOH1, GABAergiska förfäder, PTF1 alfa och Purkinje-stamcellsmarkörerna KIRREL2 och SKOR2.Dessutom observerades uttrycket av rhombisk läppmarkör OTX2 och mestadels främre neuronspecifik SIX3. Den immunofluorescerande märkningen av cellerna som skördades den 35: e dagen visade positiv färgning för cerebellummarkörerna EN2 och PTF1 alfa, neuronmarkören beta tubulin III och proliferationsmarkören KI67. Kärnfärgning med 4'6-diamidino-2-fenylindol, eller DAPI, visade cellkärnor.För en framgångsrik differentiering är det viktigt att börja med friska och odifferentierade iPSC-kolonier och använda reagenser som är så nyberedda som möjligt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Operant Sensation Seeking in musen

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modellering Neurala Immun Signalering av episodiska och kronisk migrän Använda Spridning Depression In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Lasernanosurgery av Cerebellar Axoner<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modellering Astrocytoma Pathogenesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Använda Kortikal Astrocyter eller neurala stamceller från Villkorlig, Genmanipulerade möss

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

I vitro Modellering av cancer Neural Invasion: dorsala ganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Modellering Charcot-Marie-Tooth sjukdom In Vitro av Transfecting mus primära Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...