このプロトコルでは、アフィニティークリーンアップとタンパク質タンパク質分解のためのビーズの調製方法と、乾燥したマイクロサンプルからの低存在量のタンパク質の測定にこれらを使用する方法について、段階的な概要を説明します。主な利点は、非常に少量から複雑なサンプルを非常に効率的にサンプリングして準備および実行するためのツールが提供されることです。この方法は、タンパク質またはプロテオタイプペプチドのいずれかを捕捉するための効率的な抗体にアクセスできる限り、他のタンパク質バイオマーカーに適用できます。
抗体の酸処理のためにpHを調整するとき、特に少量のビーズを準備する場合は、非常に注意する必要があります。まず、希望量の抗体溶液を5ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、抗体溶液に小さな磁気攪拌バーを追加します。微小電極付きのpHメーターを使用してpHを測定し、最初に10マイクロリットルの1モル塩酸を添加し、pHが2.5に近づくにつれて容量を減らしてpHを調整します。
pHを2.5に調整するのに必要な1モル塩酸の総量を記録します。微小電極を取り外し、酸性化抗体を氷上でマグネチックスターラー上で1時間インキュベートします。抗体溶液を中和するには、まず10マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムを添加し、pHが7に近づくにつれて水酸化ナトリウムの量を減らして、pHを測定して7に調整します。
添加した1モル水酸化ナトリウムの総量を記録します。磁気ビーズ懸濁液をボルテックスミキサーで完全に混合し、所望の量のビーズ懸濁液を含む容量を引き出します。例えば、1ミリリットルのビーズ懸濁液を調製するには、20ミリグラムのビーズを含む容量を取り出す。
ビーズ懸濁液を磁気ラックに1分間置き、上清を取り除きます。等量のI型水でビーズを2回洗浄し、洗浄液を加えるたびにボルテックスミキサーを使用して混合します。次に、溶液を再び磁気ラックに1分間置き、前に示したように上清を取り除きます。
酸処理抗体、0.5モルホウ酸緩衝液、および抗体を磁気ビーズに結合させるためのカップリングバッファーを追加します。ボルテックスミキサーを使用して混合し、エンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して周囲温度で一晩回転させ、できれば往復回転と振動を行います。その後、239gで10分間遠心分離する。
チューブを磁石の上に2分間置き、上清を取り除きます。ビーズを洗浄した後、チューブを再び磁石の上に1分間置き、同じ手順に従って上清を取り除きます。冷蔵庫内のビーズの所望のストック濃度を使用して、これを所望の緩衝液に保存する。
メーカーのガイドラインを使用して、10マイクロリットルの体積吸収マイクロサンプリング(VAMS)チップで10マイクロリットルの血清を収集し、周囲温度で少なくとも2時間風乾します。ホルダーからVAMSを取り出し、2ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに入れます。1, 000マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウム溶液を加え、1, 000 rpmの温度制御ミキサーを使用して摂氏22度で1時間VAMSを抽出します。
抽出液を新しい1.5ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、トリプシンタンパク質分解を行います。30マイクロリットルの洗浄したトリプシンビーズを各VAMS抽出物に加えて消化を開始し、温度制御ミキサーなどを使用して摂氏37度、1, 000 rpmで2時間インキュベートします。2, 655gで5分間遠心分離し、上清を新しい2ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移す。
安定同位体標識ペプチドを含む1ミリリットルあたり14ナノグラムの内部標準物質(IS)溶液を25マイクロリットル/100ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液に加えます。2つの20マイクロリットルの洗浄した磁気ビーズ懸濁液を、消化されたVAMS抽出物とISを含む各低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに追加します。周囲温度でエンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して1時間の免疫抽出を実行します。0.05%ポリソルベート20を含む500マイクロリットルのPBSを加えて磁気ビーズを洗浄します。
ビーズと洗浄液が入った低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを磁気ラックから取り出し、均質になるまで慎重に反転させます。次に、低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを磁石の上に30秒間置き、30秒間反転させてから、再び磁石の上に1分間置きます。洗浄液を取り出し、PBS、三塩酸、重炭酸アンモニウムで磁気ビーズを再洗浄します。
I型水に15マイクロリットルの2%ギ酸を加え、温度制御ミキサーなどを使用して摂氏22度、1, 000rpmで5分間インキュベートして、捕捉されたペプチドを溶出します。溶出液を磁石に1分間置いた後、新しい1.5ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。1回繰り返し、第2の溶出液を第1の溶出液と同じ低タンパク質結合性微小遠心チューブに移す。
各溶出液に20マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウムを加えます。それを遠心分離し、40マイクロリットルの溶出液をHPLCバイアル用のマイクロインサートに移します。装置ソフトウェアで、カラムオーブンの温度を摂氏25度に設定し、流量を毎分50マイクロリットルに設定します。
次に、サンプルをオートサンプラーに入れます。LC-MS/MSシステムで利用可能なソフトウェアを使用して実行するサンプルを含むシーケンスを準備し、注入量を10マイクロリットルに設定します。装置ソフトウェアのRun Sequenceを押してシーケンスを開始し、アフィニティーキャプチャされたProGRP特異的トリプシンペプチドとそのISのピーク領域を記録します。質量分析(MS)、VAMSおよび乾燥血清スポット、またはDSSサンプリング後のプロテオタイプペプチドおよびISのクロマトグラム、ならびに抽出溶液に直接添加した添加血清サンプルについて、ここに示されている。
ProGRPを添加し、VAMS、DSS、または抽出溶液に直接適用した血清サンプルのプロテオタイプProGRPペプチドのISに対するピーク面積比の代表的な結果をこの図に示します。これらの結果から、VAMSは対照サンプルと同様の面積比を提供し、サンプリング材料に損失がないことを示し、DSSは有意に低い面積比を提供し、サンプリング材料に損失を示すことがわかります。インタクトタンパク質抽出とプロテオタイプエピトープペプチド抽出後のベースピーククロマトグラムの比較をこの図に示します。
抗体または酵素コーティングされたビーズを自分で準備する場合、特定のニーズに合わせてビーズを調整できます。これは、ターゲットタンパク質の決定とグローバルプロテオミクス分析に関連しています。VAMSや乾燥血液スポットからのタンパク質測定における高感度な方法により、より幅広い疾患のフォローアップにおいて、院外検査のような患者指向のアプローチが可能になります。
