该协议具有重要意义，因为它允许首次研究细菌物种对肠道神经系统细胞的影响。由于肠道神经系统不容易接近，该模型允许研究肠道微生物组对肠道神经系统细胞的影响。将来，该模型可用于观察患病患者的肠道微生物组如何影响肠道神经系统的细胞，例如帕金森病。
未来可能的目标是将该模型与其他器官芯片模型联系起来，以构建代表肠脑轴的模型。该技术的视觉演示至关重要，因为该协议包括许多步骤，每个步骤对于成功实现该模型都至关重要。来自系统生态学实验室的博士候选人凯瑟琳·塞德拉尼（Catherine Sedrani）将演示这一过程。
首先，拧紧螺钉，固定夹子的顶部和底部，然后握住盖子角落的四个螺钉，将涂层和干燥的底部聚碳酸酯盖子从方形培养皿转移到夹具底座的顶部。使用无菌镊子定位上皮室垫圈，膜朝上放在聚碳酸酯盖上。用螺钉对齐垫圈和盖子，确保角入口和出口与垫圈开口对齐。
将三明治垫圈放在胶原蛋白垫圈的顶部，顶部朝上。然后将顶部聚碳酸酯盖放在三明治垫圈的顶部。确保夹盖上的倒钩与膜组件入口和出口开口对齐，并且底盖螺钉安装在顶盖的开口上。
要关闭设备，请将夹具盖放在聚碳酸酯盖的顶部并关闭闩锁。为了灌注管道，将带有过滤器的曝气针插入每个流入和流出瓶的隔膜中。使用干净的无菌镊子，将 120 毫米针头插入 250 毫米血清瓶中，将 80 毫米针头插入 15 毫米血清瓶中。
将每根管路末端的 40 毫米针头插入流出的血清瓶中。上皮管和神经元管线的 40 毫米针连接到同一个流出瓶上，用于培养基丢弃。细菌管线进入第二个流出瓶。
将泵管管插入泵盒。将蠕动泵设置为以 5 RPM 的速度将介质从流入瓶引导到流出瓶，然后按下启动按钮启动泵。确保油管管路的三通旋塞阀全部打开。
一旦介质落入流出瓶中，请确保管道管路和连接点中不存在泄漏或气泡。当所有管线都落入流出瓶中时，将流速设置为两个 RPM 以连接初始设备。要连接管路，请关闭三通旋塞阀，从流出侧开始。
从母诱饵连接器上断开短管，并将管子推到倒钩上，将其连接到设备的出口端口。为了实现安全的无泄漏连接，将管道一直向下推到连接器上，确保它接触到盖子。一旦一条线完全连接到设备，就打开旋塞阀。
将泵的流量设置为 2 RPM，并将泵速提高到最大 2.5 RPM，以避免因压力积聚而泄漏。让泵灌注腔室。一旦所有腔室都充满细胞培养基并且设备中没有气泡，将泵速降低到 0.5 RPM。
对于上皮细胞，使用胰蛋白酶EDTA从烧瓶中分离Caco-2细胞。将它们重悬于RPMI 1640加10%FBS中，并使用台盼蓝排除测定法在Neubauer细胞计数器中计数它们。将Caco-2细胞悬浮液以300G离心3分钟，弃去上清液以除去EDTA中剩余的行程。
将 Caco-2 细胞重悬于 RPMI 1640 加 10%FBS 中，以获得每毫升 35 万个细胞的悬浮液。将 1.5 毫升 Caco-2 细胞悬浮液转移到无菌的 2 毫升注射器中，并除去注射器中任何剩余的气泡。关闭细菌室和神经元室管路上的三通旋塞阀，并通过从转子上取下带有相应管路的盒式磁带来断开管路与泵的连接。
打开通向上皮室的流入管的旋塞阀盖，转动阀门，将介质流量从设备重定向到打开的连接器。让介质流动，直到截止阀的开口端出现一滴介质。使用滴滴连接方法将带有上皮细胞的注射器插入开放的连接器中，以防止在插入过程中引入气泡。
转动旋塞阀的阀门以阻止介质从流入瓶流动，并允许从连接的注射器流向初始设备。断开上皮室与泵的连接，缓慢按压注射器，用1.5毫升细胞悬液接种上皮室。关闭流出旋塞阀的阀门并断开注射器。
用盖子关闭旋塞阀的开口端，并保持腔室关闭至少两个小时。同时，接种神经元细胞。从培养箱中取出设备并取下管路后，慢慢打开夹子并取下盖子。
小心取下顶部聚碳酸酯盖。将培养基收集在1.5毫升微量离心管中，并将其置于冰上。轻轻取下夹层垫圈，同时从上皮室收集培养基，而不接触细胞层。
将三明治垫圈放入方形培养皿中，向细菌室中加入无菌0.9%氯化钠和水溶液，直至室完全覆盖。慢慢去除胶原垫圈，同时从神经元腔收集培养基。将培养基转移到微量离心管后，将管放在冰上。
将胶原垫圈放入方形培养皿中，轻轻地向Caco-2层中加入几毫升PBS，直到细胞层完全覆盖。将底部聚碳酸酯盖放入方形培养皿中，并在神经元细胞顶部轻轻加入约两毫升PBS，以使它们在采样过程中不会变干。将培养基管在4摄氏度下离心5分钟。
将每个管的上清液转移到新的微量离心管中后，立即将其置于干冰上。针对两种不同的初始设备设置评估了 CFU 计数。罗伊氏乳杆菌与Caco-2和罗伊氏乳杆菌在人类微生物串扰装置中共培养。
在这两种设置中，CFU 计数与 HuMix 接种物和收获的细胞显着不同，表明初始设备内细菌细胞的生长。为了评估在装置中培养肠神经元是否会改变细胞表型，使用倒置相差显微镜观察其大体形态。汇合神经元网络的建立表明细胞已很好地附着在涂层器件聚碳酸酯盖上。
汇合的神经元网络和垫圈划定的螺旋之间的边缘清晰可见。神经腐殖质的潜力在于回答以前难以解决的问题，这些问题涉及由于缺乏代表性模型而导致的人肠道微生物组与肠道神经系统之间的相互作用。
