En tarm-on-a-chip-modell for å studere tarmmikrobiom-nervesystemet

Denne protokollen er viktig da den gjør det mulig å studere en bakterieartseffekt på celler fra det enteriske nervesystemet for første gang. Siden det enteriske nervesystemet ikke er lett tilgjengelig, tillater denne modellen å studere effekten av tarmmikrobiomet på celler fra det enteriske nervesystemet. I fremtiden kan denne modellen brukes til å se hvordan tarmmikrobiomet til syke pasienter påvirker celler fra det enteriske nervesystemet, for eksempel i Parkinsons sykdom.

Et mulig fremtidig mål ville være å koble denne modellen til andre organ-on-chip-modeller for å bygge en modell som er representativ for tarm-hjerneaksen. Den visuelle demonstrasjonen av denne teknikken er kritisk, da protokollen inneholder mange trinn, og hvert trinn er avgjørende for denne vellykkede realiseringen av denne modellen. Å demonstrere denne prosedyren vil være Catherine Sedrani, en PhD-kandidat fra System Ecology Laboratory.

For å begynne, stram skruene, fest de øverste og nederste delene av klemmen, og overfør det belagte og tørkede bunnpolykarbonatlokket fra den firkantede petriskålen til toppen av klemmebunnen ved å holde de fire skruene i hjørnet av lokket. Bruk steril pinsett til å plassere pakningen i epitelkammeret med membranen vendt opp på polykarbonatlokket. Juster pakningen og lokket med skruer, slik at hjørneinnløps- og utløpsportene er på linje med pakningsåpningene.

Plasser sandwichpakningen på toppen av kollagenpakningen med oversiden vendt opp. Og legg deretter det øverste polykarbonatlokket på toppen av sandwichpakningen. Forsikre deg om at mothakene på klemmelokket stemmer overens med membranenhetens innløp og utløpsåpning, og at skruene i bunnlokket passer på åpningen av topplokket.

For å lukke enheten, plasser klemmelokket på toppen av polykarbonatlokket og lukk låsene. For priming av slangelinjene, sett inn luftingsnålene med filtre i septum for hver innstrømnings- og utstrømningsflaske. Bruk ren steril pinsett til å stikke 120 millimeter nålene inn i 250 millimeter serumflasker og 80 millimeter nåler i 15 millimeter serumflasker.

Sett 40 millimeter nålene på enden av hver slangelinje inn i en utstrømningsserumflaske. De 40 millimeter nålene i epitel- og nevronrørledningene er koblet til samme utstrømningsflaske for middels kassering. Bakterierørledningen går til den andre utstrømningsflasken.

Sett pumpeslangeledningene inn i pumpekassettene. Still inn den peristaltiske pumpen til å dirigere mediet fra innstrømningen til utstrømningsflasken med en hastighet på fem o / min, og trykk på startknappen for å starte pumpen. Forsikre deg om at de treveis stoppekranene på slangelinjene er åpne.

Når mediet faller ned i utløpsflaskene, må du kontrollere at det ikke er lekkasjer eller luftbobler i slangene og tilkoblingspunktene. Når alle rørledningene faller ned i utstrømningsflaskene, sett strømningshastigheten til to RPM for å koble til den første enheten. For å koble til en linje, lukk de treveis stoppekranventilene, og start med utstrømningssiden.

Koble den korte slangen fra hunnlokkkontakten og fest den til enhetens utløpsport ved å skyve slangen over mothaken. For en sikker lekkasjefri tilkobling, skyv slangen helt ned over kontakten, og sørg for at den kommer i kontakt med lokket. Åpne stoppekranen når en linje er helt koblet til enheten.

Sett pumpens strømningshastighet til to o / min og øk pumpehastigheten til maksimalt 2,5 o / min for å unngå lekkasjer på grunn av trykkoppbygging. La pumpen prime kamrene. Reduser pumpehastigheten til 0,5 o / min når alle kamrene er fylt med cellekulturmediet og ingen bobler er igjen i enheten.

For epitelcellene, løsne Caco-2-cellene fra kolben ved hjelp av trypsin EDTA. Re-suspendere dem i RPMI 1640 pluss 10% FBS, og telle dem i en Neubauer celle teller ved hjelp av trypan blå ekskludering analyse. Sentrifuger Caco-2-cellesuspensjonen i tre minutter ved 300 G og kast supernatanten for å fjerne de gjenværende turene i EDTA.

Resuspender Caco-2-cellene i RPMI 1640 pluss 10% FBS for å oppnå en suspensjon på 0,35 millioner celler per milliliter. Overfør 1,5 ml av Caco-2-cellesuspensjonen til en steril to milliliter sprøyte, og fjern eventuelle gjenværende luftbobler i sprøyten. Lukk de treveis stoppekranventilene på slangen til både bakterie- og nevronkamrene og koble slangen fra pumpen ved å fjerne kassettene med de respektive slangene fra rotoren.

Åpne hetten på stoppekranventilen til innstrømningsslangen som fører til epitelkammeret og vri ventilen for å omdirigere mediestrømmen fra enheten til den åpne kontakten. La mediet strømme til en dråpe av mediet kommer til syne i den åpne enden av stoppventilen. Sett sprøyten med epitelceller inn i den åpne kontakten ved hjelp av drop-drop-tilkoblingsmetoden for å forhindre innføring av luftbobler under innsettingen.

Vri ventilen på stoppekranen for å stoppe strømmen av mediet fra innløpsflasken, og for å tillate strømning fra den tilkoblede sprøyten til den første enheten. Koble epitelkammeret fra pumpen og trykk sakte på sprøyten for å inokulere epitelkammeret med 1,5 ml cellesuspensjon. Lukk ventilen på utstrømningsstoppekranen og koble fra sprøyten.

Lukk den åpne enden av stoppekranen med hetten og hold kammeret lukket i minst to timer. I mellomtiden inokulerer nevroncellene. Etter å ha fjernet enheten fra inkubatoren og fjernet slangelinjene, åpne klemmen sakte og fjern lokket.

Fjern det øverste polykarbonatlokket forsiktig. Samle mediet i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og legg det på is. Fjern forsiktig sandwichpakningen, mens du samler media fra epitelkammeret uten å berøre cellelaget.

Legg sandwichpakningen i en firkantet petriskål og tilsett steril 0,9% natriumklorid og vannoppløsning til bakteriekammeret til kammeret er helt dekket. Fjern langsomt kollagenpakningen mens du samler media fra nevronkammeret. Etter overføring av mediet til et mikrosentrifugerør, legg rørene på is.

Legg kollagenpakningen i en firkantet tallerken og tilsett forsiktig noen milliliter PBS til Caco-2-laget til cellelaget er helt dekket. Plasser det nederste polykarbonatlokket i en firkantet petriskål og tilsett forsiktig ca. to milliliter PBS på toppen av nevroncellene slik at de ikke tørker ut under prøvetakingsprosessen. Sentrifuger medierøret i fem minutter ved fire grader Celsius.

Etter å ha overført supernatantene til hvert rør til et nytt mikrosentrifugerør, legg det umiddelbart på tørris. CFU-tellingen ble vurdert for to forskjellige innledende enhetsoppsett. L.reuteri dyrket sammen med Caco-2 og L.reuteri i den menneskelige mikrobielle crosstalk-enheten.

I begge oppsettene var CFU-tellingene signifikant forskjellig fra HuMix-inokulumet og de høstede cellene som indikerer veksten av bakteriecellene inne i den første enheten. For å evaluere om dyrking av de enteriske nevronene i enheten endrer cellefenotypen, ble deres bruttomorfologi observert ved hjelp av et invertert fasekontrastmikroskop. Etableringen av et konfluent nevronnettverk indikerte at cellene hadde festet seg godt til de belagte enhetene polykarbonatlokk.

Kanten mellom det konfluente nevronnettverket og pakningsavgrenset spiral var tydelig tydelig. Potensialet til neuro humics ligger i å svare på spørsmål som tidligere var utfordrende å ta opp, angående samspillet mellom human-tarmmikrobiomet og det enteriske nervesystemet på grunn av mangelen på en representativ modell.