1.5K Views
•
09:18 min
•
July 28th, 2023
DOI :
July 28th, 2023
•0:04
Introduction
1:05
HuMiX Start
4:12
Cell Preparation and Inoculation
6:23
HuMiX Opening and Sampling on Day 14
7:51
Results: Limosilactobacillus reuteri CFU Count and Evaluating the Enteric Neuron Phenotype Alterations Within the Device
8:47
Conclusion
Transcript
Detta protokoll är viktigt eftersom det gör det möjligt att för första gången studera en bakteriearts effekt på celler från det enteriska nervsystemet. Eftersom det enteriska nervsystemet inte är lättillgängligt gör denna modell det möjligt att studera tarmmikrobiomets effekt på celler från det enteriska nervsystemet. I framtiden kan denna modell användas för att se hur tarmfloran hos sjuka patienter påverkar celler från det enteriska nervsystemet, till exempel vid Parkinsons sjukdom.
Ett möjligt framtida mål skulle vara att koppla denna modell till andra organ-on-chip-modeller för att bygga en modell som är representativ för tarm-hjärna-axeln. Den visuella demonstrationen av denna teknik är avgörande eftersom protokollet innehåller många steg och varje steg är avgörande för detta framgångsrika förverkligande av denna modell. Catherine Sedrani, doktorand från System Ecology Laboratory, kommer att demonstrera denna procedur.
För att börja, dra åt skruvarna, fäst de övre och nedre delarna av clamp, och överför det belagda och torkade nedre polykarbonatlocket från den fyrkantiga petriskålen till toppen av clamp bas genom att hålla i de fyra skruvarna i hörnet av locket. Använd steril pincett för att placera epitelkammarpackningen med membranet uppåt på polykarbonatlocket. Rikta in packningen och locket med skruvar och se till att hörninlopps- och utloppsportarna är i linje med packningsöppningarna.
Placera smörgåspackningen ovanpå kollagenpackningen med ovansidan uppåt. Och placera sedan det övre polykarbonatlocket ovanpå smörgåspackningen. Se till att hullingarna på clamp lock är i linje med membranenheternas inlopps- och utloppsöppning, och att bottenlockets skruvar passar på öppningen på topplocket.
För att stänga enheten, placera clamp lock ovanpå polykarbonatlocket och stäng spärrarna. För priming av slangledningarna, sätt in luftningsnålarna med filter i septumet på varje inflödes- och utflödesflaska. Använd en ren steril pincett och sätt in 120 millimeters nålarna i 250 millimeters serumflaskorna och 80 millimeters nålarna i 15 millimeters serumflaskorna.
Sätt in 40-millimetersnålarna i slutet av varje slang i en serumflaska med utflöde. De 40 millimeter stora nålarna i epitel- och neuronalslangarna är anslutna till samma utflödesflaska för mediekassering. Bakterieslangen går till den andra utloppsflaskan.
Sätt in pumpslangledningarna i pumpkassetterna. Ställ in den peristaltiska pumpen på att rikta media från inflödet till utflödesflaskan med en hastighet av fem varv per minut och tryck på startknappen för att starta pumpen. Se till att alla trevägskranar på slangledningarna är öppna.
När mediet faller ner i utflödesflaskorna, se till att det inte finns några läckor eller luftbubblor i slangledningarna och anslutningspunkterna. När alla rörledningar faller ner i utflödesflaskorna, ställ in flödeshastigheten på två varv per minut för att ansluta den initiala enheten. För att ansluta en ledning, stäng trevägskranventilerna, börja med utflödessidan.
Koppla bort den korta slangen från honbeteskontakten och fäst den på enhetens utloppsport genom att trycka slangen över hullingen. För en säker läckagefri anslutning, tryck slangen hela vägen ner över anslutningen och se till att den kommer i kontakt med locket. Öppna kranen när en ledning är helt ansluten till enheten.
Ställ in pumpens flödeshastighet på två varv per minut och öka pumphastigheten till maximalt 2.5 varv per minut för att undvika läckage på grund av tryckuppbyggnad. Låt pumpen fylla kamrarna. Sänk pumphastigheten till 0.5 varv per minut när alla kammare är fyllda med cellodlingsmediet och inga bubblor finns kvar i enheten.
För epitelcellerna lösgör du Caco-2-cellerna från kolven med trypsin EDTA. Suspendera dem igen i RPMI 1640 plus 10%FBS och räkna dem i en Neubauer-cellräknare med hjälp av trypan blue exclusion-analysen. Centrifugera Caco-2-cellernas suspension i tre minuter vid 300 G och kassera supernatanten för att avlägsna de återstående tripparna i EDTA.
Återsuspendera Caco-2-cellerna i RPMI 1640 plus 10%FBS för att erhålla en suspension på 0,35 miljoner celler per milliliter. Överför 1,5 ml av Caco-2-cellsuspensionen till en steril spruta på två milliliter och avlägsna eventuella kvarvarande luftbubblor i sprutan. Stäng trevägskranventilerna på slangen till både bakterie- och neuronalkamrarna och koppla bort slangen från pumpen genom att ta bort kassetterna med respektive slang från rotorn.
Öppna locket på avstängningsventilen på inflödesslangen som leder till epitelkammaren och vrid ventilen för att omdirigera medieflödet från enheten till den öppna kontakten. Låt mediet flöda tills en droppe av mediet syns i den öppna änden av avstängningsventilen. Sätt in sprutan med epitelceller i den öppna anslutningen med drop-drop-anslutningsmetoden för att förhindra att luftbubblor förs in under insättningen.
Vrid avstängningskranens ventil för att stoppa flödet av mediet från inloppsflaskan och för att tillåta flöde från den anslutna sprutan till den ursprungliga enheten. Koppla bort epitelkammaren från pumpen och tryck långsamt på sprutan för att inokulera epitelkammaren med 1,5 ml cellsuspension. Stäng ventilen på utloppskranen och koppla loss sprutan.
Stäng den öppna änden av kranen med locket och håll kammaren stängd i minst två timmar. Under tiden inokulerar du neuronala celler. Efter att ha tagit bort enheten från inkubatorn och tagit bort slangledningarna, öppna långsamt clamp och ta bort locket.
Ta försiktigt bort det övre polykarbonatlocket. Samla mediet i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och lägg det på is. Ta försiktigt bort sandwichpackningen samtidigt som du samlar upp mediet från epitelkammaren utan att vidröra celskiktet.
Placera smörgåspackningen i en fyrkantig petriskål och tillsätt steril 0,9 % natriumklorid och vattenlösning i bakteriekammaren tills kammaren är helt täckt. Ta långsamt bort kollagenpackningen samtidigt som du samlar upp mediet från neuronalkammaren. Efter att ha överfört mediet till ett mikrocentrifugrör, placera rören på is.
Placera kollagenpackningen i en fyrkantig skål och tillsätt försiktigt några milliliter PBS till Caco-2-skiktet tills cellagret är helt täckt. Placera det nedre polykarbonatlocket i en fyrkantig petriskål och tillsätt försiktigt cirka två milliliter PBS ovanpå neuronalcellerna så att de inte torkar ut under provtagningsprocessen. Centrifugera medieröret i fem minuter vid fyra grader Celsius.
Efter att ha överfört supernatanterna i varje rör till ett nytt mikrocentrifugrör, placera det omedelbart på torris. CFU-antalet utvärderades för två olika initiala enhetskonfigurationer. L.reuteri samodlades med Caco-2 och L.reuteri i den humana mikrobiella överhörningen.
I båda uppställningarna skilde sig CFU-antalet signifikant från HuMix-inokulet och de skördade cellerna, vilket indikerar tillväxten av bakteriecellerna inuti den ursprungliga enheten. För att utvärdera om odling av de enteriska nervcellerna i enheten förändrar cellfenotypen, observerades deras grova morfologi med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop. Etableringen av ett konfluentt neuronalt nätverk indikerade att cellerna hade fäst väl på de belagda enheternas polykarbonatlock.
Gränsen mellan det konfluenta neuronala nätverket och den packningsavgränsade spiralen var tydligt tydlig. Potentialen hos neurohumics ligger i att svara på frågor som tidigare var utmanande att ta itu med, angående interaktionerna mellan människans tarmmikrobiom och det enteriska nervsystemet på grund av bristen på en representativ modell.
neuroHuMiX är en avancerad gut-on-a-chip-modell för att studera interaktionerna mellan bakterie-, epitel- och neuronala celler under proximala och representativa samodlingsförhållanden. Denna modell gör det möjligt att reda ut de molekylära mekanismerna som ligger till grund för kommunikationen mellan tarmmikrobiomet och nervsystemet.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved