Denne protokol viser en rullende cirkelforstærkningsmetode til at detektere topoisomerase 1-aktivitet i råprøver på en hurtig og enkel måde. De vigtigste fordele ved denne metode er, at den er let at følge også af ikke-erfarne forskere, og den er mere følsom sammenlignet med de andre gelbaserede assays, når der anvendes rå ekstrakter. Anvendelsen af denne protokol strækker sig fra måling af responsen på lægemiddelbehandling til screening af små molekyleforbindelser med potentiel anti-cancer eller anti-infektionssygdomme effekt.
Karol Mizielinski udviklingsspecialist fra vores laboratorium demonstrerer proceduren. Til at begynde med skal du fastgøre et specialdesignet silikoneisolatorgitter til et funktionaliseret dias og derved fremstille brøndproducenten. Tryk ned på silikonegitteret for at undgå dannelse af luftbobler mellem glassets overflade og silikonen.
Forbered derefter primerblandingen ved at tilføje fem mikromolar, fem primære aminoprimere i en gangs printbuffer. Tilsæt derefter fire mikroliter af denne blanding til hver brønd og inkuber brøndproducenten i et hybridiseringskammer med mættet natriumchlorid. For at generere lukkede cirkulære substrater tilsættes to mikroliter fem mikromolære topoisomerase 1 specifikt substrat og to mikroliter af det rekombinante topoisomerase 1 enzym eller et forberedt celleekstrakt til 16 mikroliter engangs topoisomerase reaktionsbuffer.
Inkuber denne cirkelblanding ved 37 grader Celsius i 30 minutter, og stop enzymreaktionen ved at tilsætte to mikroliter 1% sds. Dyp brøndmaskinen i en bakke fyldt med buffer 1, forvarmet ved 50 grader Celsius. Pipetter bufferen ind i brøndene for at sikre, at der ikke forbliver luftbobler inde i brøndmaskinen, og inkuber derefter bakken i 30 minutter ved 50 grader Celsius.
Efter inkubation fjernes bufferen 1 og vaskes to gange med destilleret vand med kraftig omrystning i et minut mellem vask. Fjern vandet, tilsæt derefter buffer 2, forvarmet ved 50 grader Celsius til bakken, inkuber derefter og vask brøndproducenten som vist tidligere for buffer 1. Vask derefter brøndmaskinen med 70% ethanol med kraftig omrystning i et minut og brug trykluft for at lade opsætningen tørre.
For at udføre hybridisering tilsættes fire mikroliter af den forberedte cirkelblanding til hver tilsvarende brønd og placeres brøndproducenten i et fugtighedskammer med destilleret vand ved 37 grader Celsius i en time. Ved afslutningen af inkubationen vaskes brøndproducenten i et minut hver og buffer 3, buffer 4 og 70% ethanol, og lad den derefter lufttørre. Forbered og tilsæt fire mikroliter RCA-blandingen til hver brøndproducent og inkuber ved 37 grader Celsius i to timer i fugtighedskammeret.
For mikroskopisk at visualisere de forstærkede fluorescerende rullecirkelprodukter skal du først vaske diaset med buffer 3, buffer 4 og 70% ethanol. Tør rutsjebanen med trykluft, og lim den på et mikroskopglas. Marker brøndens position med en markør, og fjern derefter silikonegitteret ved hjælp af pincet.
For at muliggøre visualisering i kameraet skal du montere diaset med to mikroliter monteringsmedium uden dapi og tilføje et dækglas. Analyser diaset ved hjælp af et fluorescensmikroskop med en 60x objektiv til nedsænkning af olie og et kamera. Efter billeddannelse skal du importere billederne til billede J og stable billederne ved at klikke på Billede, derefter Stakke og billeder til stak og derefter ændre billedtypen til 8 bit.
For at indstille tærsklen skal du klikke på Billede, Juster og derefter Tærskel. Indstil den nederste bjælke til 255, og juster den øverste bjælke, så kun de rigtige signaler er røde, og baggrunden er sort. Fej gennem de enkelte billeder, og sørg for, at de svarer til billederne, før du justerer tærsklen.
Sørg for, at tærsklen er sat så lavt som muligt, før de reelle signaler begynder at forsvinde. For at tælle signalerne skal du klikke på Analysér efterfulgt af Analysér partikler og sikre, at det opsummerede felt i billedet J-indstillingerne er markeret. Tilsæt fire mikroliter fortyndet hesteradise peroxidasekonjugeret antibiotinantistof til hver brønd og inkuber ved 15 til 25 grader Celsius i 50 minutter i fugtighedskammeret.
Ved afslutningen af inkubationen vaskes brøndproducenten tre gange med buffer 5 i tre minutter hver og lad den tørre. For at visualisere kemiluminescensen tilsættes to mikroliter frisklavet ECL-luminol og hydrogenperoxidblanding til brøndene og visualiserer diaset ved hjælp af et CCD-kamera eller på røntgenfilm. Alternativt, for at visualisere med TMB, skal du fjerne silikonegitteret efter buffer 5-vask og tilføje 400 mikroliter TMB oven på hele diaset.
Opbevar diaset i et fugtighedskammer og vent i fem til 10 minutter på farveudvikling. Efter en farveudvikling skal du vaske diaset med 70% tethanol og fotografere diaset med et kamera eller en mobiltelefon til analyse med billede J-software. Importer billedet til billede J, og skift billedtypen til 8 bit ved at klikke på Billedtype og derefter 8 bit.
Begræns det målte område ved hjælp af rektangeltegningsværktøjet fra værktøjslinjen til at måle båndene separat og tegne det ønskede område. Mål intensiteten ved at klikke, analysere og derefter Måle. Flyt derefter det oprindeligt tegnede område til det næste bånd og mål.
Når du har målt intensiteten for alle båndene, skal du plotte dataene i den ønskede software. Topoisomerase 1-aktiviteten som bestemt af en fluorescerende scanneraflæsning er afbildet her, som det fremgår af kvantificeringen. Denne udlæsning har en detektionsgrænse på 12,5 nanogram, repræsentative billeder og den resulterende kvantificering opnået ved hjælp af fluorescerende mikroskopudlæsning er vist her.
Denne udlæsningsmetode har en detektionsgrænse på 0,1 nanogram, detektionstærsklen for den forbedrede kemiluminescens og farve o'metrisk udlæsningsmetoder var 6 nanogram. Ved hjælp af de samme udlæsninger var detektionsgrænsen 1.250 celler for ECL og 312 celler for TMB. Når topoisomerase 1 aktivitet blev målt fra ekstrakter af kolorektal adenocarcinom afledte celler.
Som et eksempel på en lægemiddelscreeningsapplikation blev topoisomerase 1-aktiviteten målt i nærvær af camptothecin eller dimethylsulfoxid. Kvantificeringsresultaterne viste, at camptothecin hæmmer topoisomerase 1 en medieret cirkularisering af substratet som forventet. Dette er en simpel protokol, der kun kræver særlig opmærksomhed på vasketrinnene og reaktionsinkubationstiderne.
Det er også muligt at undersøge, hvordan lægemidler hæmmer topoisomerase 1-aktivitet, ved hjælp af Reid er meget følsom og let at udføre, det tillader hurtig screening af potentielle topoisomerase 1-hæmmere og brugen af topoisomerase 1-aktivitet som biomarkør for lægemiddelrespons i kræftformer.