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December 2nd, 2022
DOI :
December 2nd, 2022
•0:04
Introduction
0:51
Preparation of Functionalized Slides
1:34
Generation of Closed Circular Substrates
2:16
Blocking of the Wellmaker and Hybridization of the Circles
3:48
Rolling Circle Amplification (RCA) and Visualization by Fluorescence Microscopy
5:54
Coupling of HRP-Conjugated Antibody to Rolling Circle Products and Visualization
7:57
Results: Detection of Topoisomerase 1 Activity Using the REEAD Assay
9:29
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल एक तेज और सरल तरीके से कच्चे नमूनों में टोपोइसोमेरेज 1 गतिविधि का पता लगाने के लिए एक रोलिंग सर्कल प्रवर्धन विधि दिखाता है। इस विधि के मुख्य लाभ यह हैं कि गैर-अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा भी इसका पालन करना आसान है, और कच्चे अर्क का उपयोग करते समय अन्य जेल-आधारित परखों की तुलना में यह अधिक संवेदनशील है। इस प्रोटोकॉल का आवेदन दवा उपचार की प्रतिक्रिया के माप से लेकर संभावित कैंसर विरोधी या संक्रामक रोगों के प्रभाव के साथ छोटे अणु यौगिकों की स्क्रीनिंग तक फैला हुआ है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन हमारी प्रयोगशाला से करोल मिज़िलिंस्की विकास विशेषज्ञ होगा। शुरू करने के लिए, एक कस्टम डिज़ाइन किए गए सिलिकॉन आइसोलेटर ग्रिड को कार्यात्मक स्लाइड में संलग्न करें, जिससे अच्छी तरह से निर्माता बन जाए। कांच की सतह और सिलिकॉन की सतह के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए सिलिकॉन ग्रिड पर नीचे दबाएं।
इसके बाद, एक बार प्रिंट बफर में पांच माइक्रोमोलर, पांच प्राइम एमिनो प्राइमर जोड़कर प्राइमर मिश्रण तैयार करें। फिर प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और संतृप्त सोडियम क्लोराइड के साथ संकरण कक्ष में कुएं के निर्माता को इनक्यूबेट करें। बंद परिपत्र सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए, पांच माइक्रोमोलर टोपोइसोमेरेस 1 विशिष्ट सब्सट्रेट के दो माइक्रोलीटर और पुनः संयोजक टोपोइसोमेरेस 1 एंजाइम के दो माइक्रोलीटर या एक तैयार सेल अर्क को एक बार टोपोइसोमेरेस प्रतिक्रिया बफर के 16 माइक्रोलीटर में जोड़ें।
इस सर्कल मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और 1% एसडी के दो माइक्रोलीटर जोड़कर एंजाइम प्रतिक्रिया को रोकें। कुएं के निर्माता को बफर 1 से भरी एक ट्रे में डुबोदें, जिसे 50 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म किया गया था। कुएं के अंदर कोई हवा का बुलबुला न रहे, यह सुनिश्चित करने के लिए बफर को कुओं में डालें, और फिर ट्रे को 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, बफर 1 को हटा दें और धोने के बीच एक मिनट के लिए जोरदार झटकों के साथ आसुत जल से दो बार धो लें। पानी निकालें, इसके बाद, बफर 2 जोड़ें, ट्रे में 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट किया गया, फिर बफर 1 के लिए पहले दिखाए गए कुएं के निर्माता को इनक्यूबेट करें और धोएं। इसके बाद, कुएं के निर्माता को 70% इथेनॉल के साथ धोएं, एक मिनट के लिए जोरदार झटकों के साथ और सेटअप को सूखने की अनुमति देने के लिए संपीड़ित हवा का उपयोग करें।
संकरण करने के लिए, तैयार सर्कल मिश्रण के चार माइक्रोलीटर को प्रत्येक संबंधित कुएं में जोड़ें और कुएं के निर्माता को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आसुत पानी के साथ आर्द्रता कक्ष में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, कुएं के निर्माता को एक मिनट के लिए धो लें और बफर 3, बफर 4 और 70% इथेनॉल, फिर इसे हवा में सूखने दें। कुएं के निर्माता के प्रत्येक कुएं में आरसीए मिश्रण के चार माइक्रोलीटर तैयार करें और जोड़ें, और आर्द्रता कक्ष में दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
प्रवर्धित फ्लोरोसेंट रोलिंग सर्कल उत्पादों को सूक्ष्म रूप से देखने के लिए, सबसे पहले, बफर 3, बफर 4 और 70% इथेनॉल के साथ स्लाइड को धोएं। संपीड़ित हवा के साथ स्लाइड को सुखाएं और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गोंद करें। एक मार्कर के साथ कुओं की स्थिति को चिह्नित करें और फिर चिमटी का उपयोग करके सिलिकॉन ग्रिड को हटा दें।
कैमरे में विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए, डैपी के बिना माउंटिंग माध्यम के दो माइक्रोलीटर के साथ स्लाइड को माउंट करें और एक कवर ग्लास जोड़ें। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइड का विश्लेषण करें, जिसमें 60x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस और एक कैमरा है। इमेजिंग के बाद, चित्रों को छवि जे में आयात करें और छवि पर क्लिक करके छवियों को स्टैक करें, फिर स्टैक्स और छवियों को स्टैक में, फिर छवि प्रकार को 8 बिट में बदलें।
दहलीज सेट करने के लिए, छवि, समायोजित और फिर दहलीज पर क्लिक करें। निचली पट्टी को 255 पर सेट करें और ऊपरी पट्टी को समायोजित करें ताकि केवल सही संकेत लाल हों और पृष्ठभूमि काली हो। व्यक्तिगत छवियों के माध्यम से स्वीप करें और सुनिश्चित करें कि वे दहलीज को समायोजित करने से पहले छवियों के अनुरूप हैं।
सुनिश्चित करें कि वास्तविक संकेत गायब होने से पहले दहलीज जितना संभव हो उतना कम सेट की गई है। संकेतों की गणना करने के लिए, विश्लेषण करें क्लिक करें, उसके बाद कणों का विश्लेषण करें और सुनिश्चित करें कि छवि जे सेटिंग्स में सारांशित फ़ील्ड की जाँच की गई है। प्रत्येक कुएं में पतला घोड़े की मूली पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और आर्द्रता कक्ष में 50 मिनट के लिए 15 से 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, कुएं के निर्माता को तीन मिनट के लिए बफर 5 के साथ तीन बार धोएं और इसे सूखने दें। केमिलुमिनेसेंस की कल्पना करने के लिए, कुओं में ताजा तैयार ईसीएल ल्यूमिनोल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और सीसीडी कैमरे या एक्स-रे फिल्मों का उपयोग करके स्लाइड की कल्पना करें। वैकल्पिक रूप से, टीएमबी के साथ कल्पना करने के लिए, बफर 5 धोने के बाद सिलिकॉन ग्रिड को हटा दें और पूरी स्लाइड के शीर्ष पर टीएमबी के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें।
स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में रखें और रंग विकास के लिए पांच से 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। रंग विकास के बाद, स्लाइड को 70% टेथेनॉल से धो लें और छवि जे सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण के लिए कैमरे या मोबाइल फोन के साथ स्लाइड को फोटोग्राफ करें। चित्र को छवि J में आयात करें और छवि प्रकार और फिर 8 बिट पर क्लिक करके छवि प्रकार को 8 बिट में बदलें।
बैंड को अलग से मापने और वांछित क्षेत्र खींचने के लिए टूलबार से आयत ड्राइंग टूल का उपयोग करके मापा क्षेत्र को सीमित करें। क्लिक करके तीव्रता को मापें, विश्लेषण करें और फिर मापें। इसके बाद, मूल रूप से खींचे गए क्षेत्र को अगले बैंड में ले जाएं और मापें।
सभी बैंड के लिए तीव्रता को मापने के बाद, वांछित सॉफ्टवेयर में डेटा प्लॉट करें। फ्लोरोसेंट स्कैनर रीडआउट द्वारा निर्धारित टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि को यहां दर्शाया गया है, जैसा कि परिमाणीकरण से स्पष्ट है। इस रीडआउट में 12.5 नैनोग्राम की पहचान सीमा है, प्रतिनिधि छवियां और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप रीडआउट का उपयोग करके प्राप्त परिणामी परिमाणीकरण को यहां दिखाया गया है।
इस रीडआउट विधि में 0.1 नैनोग्राम की पहचान सीमा है, बढ़ी हुई केमिल्यूमिनेसेंस की पहचान सीमा और रंग ओ'मीट्रिक रीडआउट विधियां 6 नैनोग्राम थीं। एक ही रीडआउट का उपयोग करते हुए, ईसीएल के लिए पहचान सीमा 1,250 कोशिकाएं और टीएमबी के लिए 312 कोशिकाएं थीं। जब टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि को कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा व्युत्पन्न कोशिकाओं के अर्क से मापा गया था।
एक दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोग के एक उदाहरण के रूप में, टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि को कैंपोथेसिन या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड की उपस्थिति में मापा गया था। परिमाणीकरण के परिणामों से पता चला है कि कैम्प्टोथेसिन टोपोइसोमेरेस 1 को सब्सट्रेट के एक मध्यस्थ परिपत्रीकरण को रोकता है जैसा कि अपेक्षित है। यह एक सरल प्रोटोकॉल है जिसे केवल धोने के चरणों और इनक्यूबेशन बार प्रतिक्रिया पर विशिष्ट ध्यान देने की आवश्यकता होती है।
यह जांचना भी संभव है कि दवाएं टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि को कैसे रोकती हैं, रीड का उपयोग करना अत्यधिक संवेदनशील और प्रदर्शन करने में आसान है, यह संभावित टोपोइसोमेरेस 1 अवरोधकों की तेजी से जांच की अनुमति देता है, और कैंसर में दवा प्रतिक्रिया के लिए बायोमार्कर के रूप में टोपोइसोमेरेज 1 गतिविधि का उपयोग करता है।
रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम गतिविधि पहचान परख का उपयोग करके टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि के संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विधि शुद्ध घटकों या सेल / ऊतक अर्क से टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने से जुड़े किसी भी क्षेत्र में व्यापक अनुप्रयोग हैं।
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